소뇌 뉴런 시각화를 위한 제브라피시 애벌레 뇌의 생체 내 이미징

초록

출처: Schramm, P. et al. 두개골 및 피부 제거에 의한 깨어 있는 제브라피시 유충 및 청소년의 완전 활성 뇌 조직의 생체 내 이미징. J. Vis. Exp. (2021)

이 비디오는 Purkinje 뉴런에서 형광 단백질을 발현하는 형질전환 제브라피시 유충의 소뇌 뉴런의 생체 내 이미징을 보여줍니다. 이 과정에는 유충을 마취하고, 아가로스로 고정시키고, 착색된 피부를 조심스럽게 제거하여 빛 투과와 형광 강도를 향상시키는 것이 포함됩니다. 마지막으로, 준비된 표본을 컨포칼 현미경으로 이미지화하여 표지된 뉴런을 명확하게 시각화합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 유충 마취 및 매립 준비
   1. 그날의 실험을 시작할 때, 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 필요한 동물을 Danieau(Danieau와 함께 Petri 접시에 보관되는 유충의 경우) 또는 어류 시설의 물(수정 후 7일이 지난 유충의 경우[dpf])으로 채워진 직경 90mm의 페트리 접시로 옮깁니다. 물고기 시설에서).
      1. 2주가 넘은 생선을 피펫팅할 때는 물고기를 옮길 때 물고기가 다치지 않도록 피펫 입구가 충분히 큰지 확인하십시오. 그물은 물고기, 특히 어린 유충에게 신체적으로 해를 끼칠 수 있으므로 사용하지 마십시오.
   2. 페트리 접시에 보관된 유충의 크기에 적합한 rotifera 또는 artemia nauplii를 추가하여 먹이에 대한 자유로운 접근과 유충의 최대 건강 상태를 보장하고 스트레스를 줄입니다.
   3. 포매를 위해 선택한 유충을 인공 뇌척수액(ACSF)으로 채워진 35mm 직경의 페트리 접시로 옮깁니다. 10μM의 작동 농도/유효 용량에 도달하기 위해 필요한 양의 d-Tubocurarine을 추가하고 유충이 완전히 고정될 때까지 몇 분 동안 기다립니다.
      참고: 물고기가 나이가 들거나 더 빠른 완전 마취가 필요한 경우(5분 미만) d-투보쿠라린의 농도를 높일 수 있습니다(마우스의 LD50은 정맥 주사 시 0.13mg/kg). α-bungarotoxin(작업 농도: 1mg/mL)과 같은 다른 마취제를 사용하는 것도 가능한데, 이는 큐라레와 동일한 효과를 가지며 뇌를 완전히 활동적으로 유지합니다. 관심 대상자에게 완전히 활성화된 뇌가 필요하지 않은 경우, 치명적이지 않은 용량(0.02%)의 트리카인을 투여하는 것도 유충을 완전히 마취시키는 옵션입니다. 그러나 트리카인은 나트륨 채널을 차단하여 뇌 활동을 손상시킵니다.
   4. 직경 35mm의 페트리 접시의 뚜껑을 잡고 뚜껑을 거꾸로 뒤집어 뚜껑 바닥에 사각형 유리 커버슬립(24 x 24mm)을 올려 장착실을 준비합니다. 이 단계에 대한 개략적인 설명은 그림 1(상단)을 참조하십시오. 유리의 표면이 더 매끄러워서 두개골 개방 절차 중에 유충이 들어있는 아가로 스 블록에서 미끄러지는 것을 방지합니다.
   5. 적절한 바이알(예: 50mL 튜브, 비커, Schott 병 등)에 하루 동안 필요한 ACSF의 양을 분취하고 탄수화물(5% CO₂, 95% O₂)로 산소를 공급합니다. 형태학(예: 형광 패턴)만 이미징하는 경우 ACSF는 뇌의 무결성을 보장하고 세포가 삼투압 효과에 의해 부정적인 영향을 받지 않도록 하기 위해 여전히 필요하지만 ACSF의 산소화는 필요하지 않습니다. 이 단계는 이미징을 위해 완전한 뇌 활동이 필요한 경우에만 수행해야 합니다.
      참고: 매체의 최적 산소 포화도를 위해 탄화관 끝에 에어 스톤을 추가합니다. 충분히 높은 산소 농도를 보장하려면 동일한 이미징 챔버에 포함된 유충의 수와 연령에 따라 20-60분마다 이미징 챔버의 ACSF를 갓 산소가 공급된 ACSF로 교환해야 합니다(예: 단일 임베디드 유충 ACSF의 경우 1시간마다 교환하는 것으로 충분합니다). 14 dpf보다 오래된 6 마리의 유충이 병렬로 박혀 있는 경우 20분마다 ACSF를 교환해야 함) 따라서 계획된 실험에 따라 필요한 양의 산소 포화 ACSF를 계획합니다.
2. 유충의 포매하기
   1. 완전히 마취된 유충을 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 (1.4단계에서) 준비된 장착 챔버로 옮깁니다. 그런 다음, 저융융(LM) 아가로스의 희석을 피하기 위해 초과 매체를 조심스럽게 제거합니다. 다음 모든 단계는 충분한 배율로 실체 현미경 아래에서 수행해야 합니다.
      참고: 마운팅 챔버를 기울이면 매체를 완전히 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다.
   2. 유충 위에 충분히 큰 LM-아가로스 방울을 추가하여(유충의 크기에 따라 약 1mL) 동물이 건조해지는 것을 방지하고 불필요한 스트레스를 줄여 다음 단계를 즉시 진행하십시오.
   3. 아가로스가 굳어지기 전에 유충을 제자리로 향하게 합니다. 유충의 등쪽 부분이 위쪽을 향하도록 하십시오. 또한 유충을 아가로스 표면에 최대한 가깝게 삽입해야 합니다.
      참고: 동시에 교착 예정인 유충의 크기와 수에 따라 아가로스 농도를 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 30dpf 된 1-3 마리의 유충의 경우 1.8 % -2 % LM- 아가로 로즈의 농도가 권장됩니다. 7 dpf 된 1-4 마리의 유충의 경우 2.5 % LM- 아가로 오스를 사용하는 것이 가장 실용적이며 5-8 마리의 유충의 경우 2 %가 더 적합합니다. 완전히 활동적인 뇌가 필요한 경우 유충을 운영하는 데 필요한 시간을 줄이기 위해 동시에 세 마리의 물고기만 삽입하는 것이 좋습니다. 일반적으로 유충이 나이가 들수록 더 낮은 농도(1.8%-2%)를 사용하거나 더 많은 유충이 동시에 내장될 계획입니다.
   4. 도립 현미경을 사용하여 이미지를 기록하는 경우 유충이 포함된 아가로스 블록을 작은 직육면체 모양으로 자릅니다. 이것은 나중에 유충을 이미징 챔버로 옮기는 데 중요합니다. 정립 현미경을 사용하는 경우 장착 챔버를 이미징 챔버로도 사용할 수 있으므로 이러한 트리밍이 필요하지 않습니다. 그림 1(상단)에서 이 단계에 대한 개략적인 설명을 찾을 수 있습니다.
3. 뇌 노출
   참고: 다음의 모든 단계는 유충이 불필요하게 다치지 않도록 최대한 주의하여 수행해야 합니다. 실험에 완전히 활성화된 뇌가 필요한 경우, 물고기가 여전히 아가로스에 완전히 장착되어 있고 산소가 공급되지 않은 두개골이 열려 있는 동안에는 매초마다 뇌가 산소 부족으로 고통받고 건조해진다는 점을 명심하십시오. 산소 결핍의 영향은 내장된 유충이 나이가 많을수록 훨씬 더 극적으로 나타납니다. 따라서 바늘로 인한 기계적 뇌 손상을 방지하기 위해 가능한 한 최단 시간 내에 수술을 수행하는 것뿐만 아니라 최대한의 정밀도로 수술을 수행하는 것이 중요합니다. 3.2-3.4 단계는 훈련 시 물고기 한 마리당 30초 이상 걸리지 않아야 합니다.
4. 아가로스가 굳어지자마자 수술을 시작하십시오. 먼저, 뇌의 관심 영역 위에 있는 여분의 아가로스를 모두 잘라내어 머리에 자유롭게 접근할 수 있고 작업 공간을 확보합니다. 머리의 등 부분이 이미 아가로즈 밖으로 튀어나와 있으면 이 단계를 건너뜁니다.
5. 관심 지역에 따라 수술을 시작할 장소를 선택하십시오. 유리 바늘을 잡고 조직에 너무 깊숙이 침투하지 않도록 피부를 작게 절개합니다. 이것은 오버레이 된 피부를 벗겨내는 시작점이 될 것입니다.
   참고: 최적의 결과를 얻으려면 중요한 구조물의 손상 위험을 줄이기 위해 관심 영역 바로 위에서 시작하지 마십시오. 필요한 경우, 후뇌 후방에서 시작하여 원치 않는 피부 부위가 벗겨질 때까지 앞으로 작업할 수 있습니다.
6. 피부 부분을 따라 아주 작은 상처를 계속 자르고 표면 바로 아래의 바늘을 거의 움직이지 않아 제거하는 것을 목표로 합니다. 대부분의 경우 뇌 주위를 완전히 돌아다니며 원 모양의 피부와 두개골 조각을 잘라낼 필요는 없으며, 머리를 따라 두 군데를 절개한 다음 피부를 한쪽 또는 다른 쪽으로 밀어냅니다. 그림 2는 소뇌에 자유롭게 접근하기 위한 최적의 절단 전략의 개략도를 보여줍니다.
   참고: 이 미세 수술은 섬세한 절차이며, 근본적인 뇌를 손상시키지 않고 피부를 완벽하게 제거하려면 약간의 훈련이 필요할 가능성이 큽니다. 또한 관심 있는 뇌 영역에 대한 최적의 절단 전략을 찾고 실험 기간 동안 이를 고수하는 것이 좋습니다.
7. 매립된 모든 유충의 피부를 제거한 직후 아가로스 위에 ACSF를 부어(산소화) 하여 원치 않는 피부 입자와 혈액을 넘쳐나게 하고 뇌를 완전히 활성 상태로 유지하며 건조하지 않도록 보호합니다.
   참고: 실험에 건강한 뇌가 필요하다면 한 번에 최대 3마리의 물고기를 잡는 것이 좋습니다.
8. 정립 현미경을 사용하는 경우 이미징부터 바로 시작하십시오.
   1. 도립 현미경을 사용하는 경우 직육면체 아가로스 블록 아래에 작은 주걱을 밀어 넣습니다(2.4단계).
   2. 이미징 챔버 바닥(예: 유리 바닥 접시)에 LM-아가로스 한 방울을 떨어뜨리고 즉시 주걱으로 유충이 들어 있는 아가로스 블록을 180° 뒤집어 이미징 챔버 바닥으로 부드럽게 밀어 넣으면 액체 아가로스 방울이 접착제 역할을 합니다.
   3. 아가로스가 응고되면 이미징 챔버를 (산소화된) ACSF로 채운 다음 이미징을 시작합니다. 개략적인 설명은 그림 1(하단)을 참조하십시오.
9. 실험을 위해 완전한 뇌 활동이 필요한 경우 항상 이미징 챔버의 ACSF가 충분히 높은 산소 수준을 가지고 있는지 확인하십시오. 이를 보장하기 위해 배지를 20-60분마다 갓 산소를 공급한 ACSF로 조심스럽게 교체해야 합니다(물고기의 수와 크기, 이미징 챔버의 크기와 표면, 이미징 시간에 따라 다름).

결과

그림 1: 생체 내 이미징을 위한 개방형 두개골 제브라피시를 단계적으로 준비하기 위한 개략적인 절차. 다양한 단계에 대한 작업 지침은 그래픽 자체에서 찾을 수 있습니다. Florian Hetsch가 디자인하고 Paul Schramm이 각색한 그래픽.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경	Leica	TCS SP8
d-Tubocurare	Sigma-Aldrich	T2379-100MG
유리 모세관 유형 1	WPI	1B150F-4
유리 모세관 유형 2	Harvard Apparatus	GC100F-10
유리 커버 슬립	deltalab	D102424
이미징 챔버	Ibidi	81156
LM-Agarose	Condalab	8050.55
현미경 카메라	Leica	DFC9000 GTC
니들 풀러 유형 1	NARISHIGE	모델 PC-10
니들 풀러 유형 2	셔터 기기	모델 P-2000
파스퇴르 피펫 3ml	A.Hartenstein	20170718
Tricain	Sigma-Aldrich	E10521-50G
35mm 페트리 접시	Sarstedt	833900
90mm 페트리 접시	Sarstedt	821473001