원자력 현미경을 사용한 마우스 뇌 조직의 기계적 특성 특성화

출처: Canovic, E. P., et al. 원자력 현미경, 충격 압흔 및 유변 물성 측정을 사용하여 뇌 조직의 다중 스케일 기계적 특성을 특성화합니다. J. Vis. Exp. (2016)

이 비디오는 구형 프로브가 있는 캔틸레버가 조직과 상호 작용하고 가해진 힘에 의해 구부러지는 뇌 조직의 점탄성 특성을 측정하기 위해 원자력 현미경(AFM)을 사용하는 방법을 보여줍니다. 검출기로 편향된 레이저 빔은 캔틸레버를 추적하여 압흔 깊이와 힘 완화를 측정하여 조직의 기계적 특성을 특성화할 수 있습니다.

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.

1. 원자력 현미경(AFM) 지원 압흔

제조업체의 지침에 따라 홍합 유래 바이오 접착제로 직경 60mm의 페트리(P60) 접시를 준비합니다.
1. 최적의 pH 8.0으로 멸균수에 0.1M 중탄산나트륨으로 구성된 중성 완충 용액을 준비합니다. 중탄산나트륨 완충액을 필터 멸균(0.2미크론)하고 4°C에서 보관합니다.
2. 층류 후드에서 중탄산나트륨 완충액에 6.25% 홍합 유래 바이오 접착제와 3.125% 수산화나트륨(NaOH) 용액을 혼합합니다.
3. 직경 60mm의 페트리(P60) 접시에 바이오 접착 용액 100μl를 피펫팅하고 피펫 팁을 사용하여 용액을 직경 3-5cm의 원으로 펴 바릅니다.
4. P60 접시를 층류 후드에 덮지 않은 상태로 두고 용액을 건조시킵니다(~30분). 식기는 인산염 완충 식염수(PBS)로 1회, 멸균수로 2회 세척합니다. 접시를 층류 후드에서 자연 건조시키고 4°C의 밀봉된 비닐 봉지에 넣어 최대 1개월 동안 보관하십시오.
AFM을 보정하고 AFM에서 뇌 샘플을 설정합니다. 참고: 제조업체에 따라 AFM 교정 지침을 따르십시오.
1. 공칭 스프링 상수가 0.03N/m이고 직경이 20μm인 붕규산 비드를 사용하여 AFM 프로브를 프로브 홀더에 조심스럽게 로드합니다.
2. Thermal tune 방법을 사용하여 AFM 캔틸레버의 스프링 상수 및 역 광학 레버 감도(InvOLS)를 보정합니다.
  참고: AFM 프로브의 스프링 상수가 계산되면 반복 사용해도 일정하게 유지되어야 합니다. 그러나 캔틸레버 InvOLS는 레이저가 캔틸레버와 재정렬될 때마다 다시 보정해야 합니다. 또한, 교정은 폴리스티렌과 같은 캔틸레버보다 몇 배 더 단단한 기판에 대해 수행되어야 합니다.
3. 무대에 장착된 히터를 켜고 온도를 37°C로 설정합니다.
4. P60 접시에 브레인 슬라이스를 장착합니다.
  1. 350μm 두께의 뇌 절편과 둥근 바닥 플라스크의 이산화탄소(CO₂) 독립 배지를 홍합에서 추출한 바이오 접착제로 코팅된 P60 접시에 부드럽게 붓습니다.
  2. P60 접시를 부드럽게 기울여 브레인 슬라이스를 중앙에 놓습니다. 필요한 경우 수동 피펫에서 배지를 천천히 피펫으로 연결하여 접힌 뇌 조각을 펼치거나 더 나은 방법은 뇌 조각을 접시 중앙에 배치하는 것입니다.
  3. P1000 피펫을 사용하여 여분의 매체를 조심스럽게 제거합니다(진공 청소기를 사용하지 마십시오).
  4. P60 접시에 덮개를 씌우고 브레인 슬라이스가 20분 동안 접착되도록 합니다.
5. AFM 헤드를 제거하고 P60 접시에 장착된 브레인 슬라이스를 AFM 스테이지에 놓고 ~2ml 예열 CO₂ 독립 배지를 추가합니다.
6. AFM 프로브에 매체 한 방울을 조심스럽게 추가하여 뇌 절편을 둘러싼 매체로 내려갈 때 표면 장력으로 인해 파손되지 않도록 보호합니다.
7. AFM 헤드를 무대로 재배치하고 미디어에 잠길 때까지 머리를 내리기 시작합니다.
8. 상단 보기 CCD(charge-coupled device) 카메라를 사용하여 레이저를 캔틸레버에 재배치합니다.
  참고: 캔틸레버의 레이저 정렬은 공기와 매질의 굴절률 차이로 인해 약간 변경되었습니다.
9. 캔틸레버가 따뜻한 액체에 잠길 때까지 5분 동안 기다린 다음 미러 정렬을 0V의 자유 편향으로 재설정합니다.
10. 제조업체의 지침에 따라 AFM 프로브에서 열 스펙트럼을 실행합니다. 첫 번째 열 피크의 피팅을 사용하여 미디어에서 AFM 프로브의 InvOLS를 다시 계산합니다.
11. 광학 현미경을 사용하여 관심 뇌 영역이 AFM 프로브 아래에 있도록 샘플 스테이지를 이동합니다. 참고: corpus callosum은 주변의 회백질보다 더 불투명하기 때문에 어둡게 보입니다. 피질은 말뭉치(corpus callosum)보다 우수합니다. 위치
12. 미러 정렬을 0V의 자유 편향으로 재설정합니다.
13. AFM 소프트웨어의 합 및 편향 측정기에서 "Engage"를 클릭하여 AFM 헤드를 맞물립니다.
14. AFM 헤드의 위치 다이얼을 사용하여 캔틸레버와 샘플이 접촉할 때까지 헤드를 내립니다.
크리프 규정 준수 실험을 수행합니다.
1. 소프트웨어의 함수 편집기에서 적용된 힘 함수를 구성합니다. 힘 함수는 0.1초 동안 5nN의 설정점까지 램프하고 20초 동안 유지한 다음 0nN의 적용된 힘까지 1초 램프로 구성됩니다.
  1. 인덴테이션 마스터 패널의 인덴테이션 방법에서 인덴터 모드에 대해 "로드", 단위에 대해 "N", 인덴터 기능에 대해 "기능 편집기"를 선택합니다.
  2. 함수 편집기의 세그먼트 Parms 패널에서 0.1초의 시간으로 0 nN에서 시작하여 5 nN에서 끝나는 적용된 힘 함수 세그먼트를 생성합니다. "Insert -->"를 클릭합니다.
  3. 다음 세그먼트의 경우 시작을 5nN으로, 끝을 5nN으로, 시간을 20초로 설정합니다. "삽입 -->"을 클릭합니다.
  4. 마지막 세그먼트의 경우 시작을 5nN으로, 끝을 0nN으로, 시간을 1초로 설정합니다. 그런 다음 "그리기"를 클릭하고 함수 편집기 창을 닫습니다.
2. 마스터 패널의 포스 탭에서 "트리거 후 인덴터 램프"를 선택하고 0.1 V의 트리거 포인트에 도달한 후 적용된 힘 함수를 트리거하도록 설정합니다.
3. 마스터 패널의 포스 탭 하단에 있는 "Single Force"를 클릭하면 크리프 컴플라이언스를 위해 구성-적용된 힘 함수가 트리거됩니다.
4. 단일 힘 압입이 완료된 후 AFM 헤드를 들어 올려 샘플과 접촉하지 않도록 합니다. 그런 다음 머리를 다시 맞물리고 자유 편향을 다시 영점화합니다.
5. 샘플 스테이지의 위치를 변경하여 새로운 관심 영역을 찾고 AFM 헤드를 내려 접촉합니다. 참고: 샘플 스테이지가 이동할 때 AFM 헤드는 샘플 표면에서 후퇴해야 합니다. 그렇지 않으면 섬세한 AFM 캔틸레버가 손상될 수 있습니다.
6. 원하는 양의 데이터가 수집될 때까지 단계를 반복합니다.
힘 이완 실험을 수행합니다.
1. 소프트웨어의 기능 편집기에서 적용된 압흔 기능을 구성합니다. 인덴테이션 기능은 3μm의 설정점까지 0.1초 램프를 하고 20초 동안 유지한 다음 0μm의 인덴테이션 깊이까지 1초 램프를 내리는 것으로 구성됩니다.
  1. 인덴테이션 마스터 패널의 인덴테이션 방법에서 인덴터 모드에 대해 "인덴테이션"을 선택합니다. "m"은 단위, "Function editor"는 Indenter Function을 나타냅니다.
  2. 함수 편집기의 Segment Parms Panel에서 0.1초의 시간으로 0μm에서 시작하여 3μm에서 끝나는 적용된 힘 함수 세그먼트를 생성합니다. "Insert -->"를 클릭합니다.
  3. 다음 세그먼트의 경우 시작을 3μm, 끝을 3μm, 시간을 20초로 설정합니다. "삽입 -->"을 클릭합니다.
  4. 마지막 세그먼트의 경우 시작을 3μm, 끝을 0μm, 시간을 1초로 설정합니다. 그런 다음 "그리기"를 클릭하고 함수 편집기 창을 닫습니다.
2. 마스터 패널의 포스 탭에서 "트리거 후 인덴터 램프"를 체크하고 0.1 V의 트리거 포인트에 도달한 후 적용된 힘 기능을 트리거하도록 설정합니다.
3. 마스터 패널의 포스 탭 하단의 "단일 힘"을 클릭하여 힘 완화를 위해 구성된 적용된 들여쓰기 기능을 트리거합니다.
4. 단일 힘 압입이 완료된 후 AFM 헤드를 올려 샘플과 접촉하지 않도록 한 다음 헤드를 다시 결합하고 처짐을 다시 영점 조정하십시오.
5. 스테이지의 위치를 변경하여 새로운 관심 영역을 찾고 고개를 숙여 접촉합니다.
6. 원하는 양의 데이터가 수집될 때까지 두 측정을 모두 반복합니다.

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Hibernate-A 매체	Gibco	A1247501	CO₂-성인 조직용 독립 신경 매체
원자력 현미경, MFP-3D-BIO	망명 연구	-
페트리 식기 히터	망명 연구
AFM 프로브, 0.03 N/m, 10 um 반경 붕규산 구체	노바스캔	PT. GS
셀탁	코닝	354240	홍합 유래 바이오 접착제
중탄산나트륨	시그마-알드리치	S5761	대체 공급 업체 사용 가능
수산화나트륨, 1N	시그마-알드리치	59223C	대체 공급업체 사용 가능

원자력 현미경을 사용한 마우스 뇌 조직의 기계적 특성 특성화

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