마우스 뇌 조직의 기계적 특성을 평가하기 위한 충격 압흔(Impact Indentation)

초록

출처: Canovic, E. P., et. al., 원자력 현미경, 충격 압흔 및 유변 물성 측정을 사용하여 뇌 조직의 다중 스케일 기계적 특성을 특성화합니다. J. Vis. Exp. (2016)

이 비디오는 프로브 변위 및 속도 분석을 통해 강성, 에너지 소산 및 댐핑을 포함한 수화된 마우스 뇌 조직의 기계적 특성을 측정하기 위해 충격 압입을 사용하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.

1. Impact Indentation
   1. 제조업체의 지침에 따라 수화된 뇌 조직에 대한 동적 충격 실험을 가능하게 하기 위해 계측된 나노 인덴터를 보정하고 기본 설정을 조정합니다.
      1. 핀셋을 사용하여 구형 프로브를 진자에 밀어 장착합니다.
      2. 용융 석영 샘플을 변환 단계에 나사로 고정된 샘플 포스트에 붙입니다.
      3. 보정 메뉴로 이동하여 "Liquid Cell"을 선택합니다. 소프트웨어의 지침에 따라 용융 석영 샘플과 접촉하십시오.
      4. Indenter Type에 대해 "Normal"을 선택하고 Indenter Load에 대해 기본값 0.05mN을 사용합니다. "계속"을 클릭하여 일반 인덴터 구성에 대한 보정을 수행합니다.
      5. s를 이동ample stage를 최소 5mm 뒤로 이동합니다. 프로브를 액체 셀로 내릴 수 있는 레버 암을 장착하고 Indenter Type에 대해 "Liquid Cell"을 선택하여 새 구성에서 액체 셀 보정을 반복합니다. "Continue(계속)"를 클릭하여 Liquid Cell Calibration Factor를 구합니다.
      6. Experiment 메뉴로 이동하여 "Special Options"를 선택하여 Liquid Cell 소프트웨어 옵션을 활성화합니다. 최신 보정 값을 사용합니다.
      7. 커패시터 플레이트 간격을 늘리면 측정 가능한 최대 깊이가 커지며, 이는 규정 준수가 높은 재료를 테스트할 때 필요합니다.
         1. 시스템 메뉴에서 "Non Protected Settings" 및 "Machine Parameters"를 선택하여 진자 테스트 부하 속도, 제로 부하 속도 및 대기 램프 오프셋을 각각 0.5mN/sec, 0.1mN/sec 및 3V로 변경합니다.
         2. 렌치를 사용하여 커패시터 플레이트 간격을 제어하는 세 개의 너트를 시계 방향으로 조금씩 돌립니다.
         3. 시계 방향으로 완전히 돌릴 때마다 유지 관리 메뉴에서 "브리지 박스 조정"을 선택하고 카운터 밸런스 웨이트를 진자에서 멀리 이동해야 하는 양호한 진자 테스트를 얻습니다.
         4. 대략적인 깊이 보정이 70,000nm/V 이상의 값을 읽을 때까지 1.1.7.2-1.1.7.3 단계를 반복합니다.
      8. 전원 공급 장치를 통해 켜고 끌 수 있는 진자 바닥에 새로운 제한 정지를 배치합니다. 원래 한계를 후퇴시키고 진자 뒤에 앉는 것을 멈추어 진자 운동의 잠재적인 방해물을 제거하고 더 높은 충격 속도와 규정 준수 샘플에 대한 더 높은 침투 깊이를 허용합니다.
      9. 캐비닛이 열 평형에 도달하도록 합니다(약 1시간 소요).
      10. 캐비닛이 평형을 이루는 동안 시스템 메뉴로 돌아가서 "보호되지 않은 설정" 및 "기계 매개변수"를 선택합니다. 깊이 보정(dcal) 접촉 속도를 1μm/sec로, 기본 압흔 접촉 속도를 3μm/sec로, 초저부하 접촉 속도를 1μm/sec로 설정합니다.
      11. Calibration(보정) 메뉴에서 이 새로운 구성에서 표준 깊이 보정을 수행합니다.
      12. 솔레노이드의 전원을 켜고 10V로 설정합니다. 실험 메뉴로 이동하여 "충격"과 "임펄스 변위 조정"을 선택합니다. 소프트웨어 지침(자동 프롬프트)에 따라 진자의 스윙 거리를 보정합니다.
2. 쥐의 뇌 조직을 액체 세포에 장착합니다.
   1. 뇌 전체를 채취한 후 얼음 위의 성인 신경 조직 배지를 위한 CO₂ 독립 영양 배지에 즉시 보관하십시오.
   2. 임팩트 인덴테이션 설정이 완전히 완료되면 CO₂ 독립 매체와 함께 뇌를 페트리 접시에 조심스럽게 옮깁니다. 뇌를 양쪽에 평평한 표면이 있는 6mm 두께의 부분으로 자릅니다.
   3. 얇게 썬 조직을 시아노아크릴레이트 접착제의 얇은 층으로 알루미늄 샘플 포스트에 부착합니다.
   4. 액체 셀을 s의 두 번째 O-링 위로 밀어 넣습니다.ample 포스트, 액체 셀에 5ml의 CO₂ 독립 매체를 채워 조직을 완전히 담그십시오. 그런 다음 이 샘플 포스트를 계측된 나노인덴터 내부의 translational stage에 조심스럽게 장착합니다.
3. 뇌 조직의 충격 반응을 측정합니다.
   1. 필요한 경우 구형 프로브를 제거하고 레버 암을 제거하지 않고 관심 프로브로 교체합니다.
   2. 시스템 메뉴에서 "보호되지 않은 설정" 및 "컴퓨터 매개변수"를 선택합니다. 1차 충격 접촉 속도를 5μm/sec로 변경합니다.
   3. 샘플 수조가 낮고(-z 방향) 진자에서 멀리 떨어진 상태(+x 방향)에서 레버 암의 끝이 수조 위에 제대로 위치할 때까지 -x 방향으로 이동합니다. 팁이 수조에 완전히 잠길 때까지 +z 방향으로 이동합니다.amp르 앞
   .
   4. 샘플 스테이지 제어 창을 사용하여 조심스럽게 접촉한 다음 스테이지를 샘플 표면에서 약 30μm 떨어뜨립니다.
   5. 실험 메뉴에서 "영향"을 클릭하여 영향 실험을 설정합니다. 스윙 거리 보정을 기반으로 결과 충격 속도와 직접 관련되는 특정 임펄스 부하를 선택하십시오. 예약된 실험을 실행합니다.
   6. 진자가 뒤로 흔들리고 샘플 표면이 측정 평면으로 계속 이동하면 하단 한계 정지 스위치를 끕니다.
   7. 진자가 샘플에 충격을 가하기 위해 앞으로 스윙하는 것을 관찰하십시오. 시간의 함수로 인한 프로브의 변위는 소프트웨어에 의해 기록됩니다.
   8. xyz 스테이지 창이 나타나면 리미트 스톱 스위치를 다시 켭니다.
   9. 3.4-3.8단계를 반복하여 필요한 만큼 다양한 하중과 위치를 테스트합니다.
4. 사용자 지정 MATLAB 스크립트를 사용하여 진자의 획득된 변위 대 시간 응답을 분석하여 최대 침투 깊이 xmax, 에너지 소산 용량 K 및 소산 품질 계수 Q를 결정할 수 있습니다.
   1. 분석 메뉴로 이동하여 데이터를 텍스트 파일로 내보냅니다.
   2. 변위 프로파일의 시간 도함수를 사용하여 속도를 시간 함수로 구합니다. 접점 xo1.
      참고: 충격 속도 vin은 접촉 직전의 최대 속도입니다. xmax는 프로브 속도가 먼저 0으로 감소하는 변형에 해당합니다. XR에 해당하는 xO2는 다음 사이클에서 변형된 샘플과의 접촉을 다시 시작하는 데 필요한 위치입니다. 반동 속도 vout은 변위 xr에서의 속도입니다.
   3. K(단위 없음)를 첫 번째 충격 주기 동안 회수된 샘플 에너지와 소산된 샘플 에너지의 합으로 정규화된 샘플에 의해 소산되는 에너지로 정의합니다. 진자의 고유 속성(예: 회전 강성 및 감쇠 계수), xo1, xmax, xr, vin 및 vout을 기반으로 K를 계산합니다.
   4. 변위는 감쇠된 고조파 진동 운동으로 설명할 수 있으므로 지수 감쇠 함수를 변위 대 시간 곡선의 최대값에 맞춥니다.
   5. Q(단위 없음)를 진동 진폭이 감소하는 데 필요한 사이클 수를 π e배로 곱한 값으로 계산합니다. Q 값이 높을수록 에너지 소산 속도가 낮다는 것을 의미합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Hibernate-A Medium	Gibco	A1247501	성체 조직용 이산화탄소 독립적 신경 매체
Cell-Tak	Corning	354240	홍합 유래 바이오 접착제
계장화 압자, NanoTest Vantage	Micro Materials Ltd.		프로브 팁 가공 필요(강철 플랫 펀치, 직경 1mm, 길이 4-5mm)
NanoTest Liquid Cell	Micro Materials Ltd.