동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 분석을 위한 LA-ICP-MS 준비
- 표준물질과 샘플을 절제 챔버에 배치하여 LA 장치에 장착된 CCD 카메라의 피사계 심도 내에 있는지 확인합니다. 기기 조정이 필요한 경우 적절한 참조 물질(예: NIST 612 유리 내 미량 원소)을 포함하십시오. 챔버 도어에 있는 두 개의 나사를 손가락으로 조여 절제 챔버를 밀봉합니다.
- ICP-MS 소프트웨어의 '유지 관리' 또는 이와 유사한 패널에서 아르곤 가스 밸브를 열고 해당 대화 상자에서 운반 가스 흐름을 1.2L min-1로 설정합니다.
참고: 이 프로토콜에서 아르곤은 운반 가스로 사용됩니다. 몇 가지 예는 헬륨 또는 헬륨과 아르곤의 혼합물을 운반 가스로 사용합니다. - LA 소프트웨어에서 '퍼지' 버튼을 클릭하여 최소 30분 동안 아르곤 가스로 셀을 플러시합니다.
참고: 퍼지 시간은 '퍼지 시간' 또는 이와 유사한 버튼을 클릭하여 변경할 수 있습니다. 2부피 절제 셀이 있는 절제 시스템을 사용하는 경우 주기적으로 스테이지를 각 모서리로 이동하고 셀을 대각선으로 가로지르며 셀에서 가능한 한 많은 잔류 공기가 제거되도록 합니다. 이는 '홈 스테이지' 또는 이에 상응하는 기능을 선택하여 달성할 수 있습니다. - '플라즈마 켜기'를 클릭하여 ICP-MS를 켜고 2시간 동안 예열한 후 1.5 - 2.4 단계를 수행할 수 있습니다. 기기 설정은 제조업체마다 다릅니다.
- 조직 표준의 대표적인 절제
- 선 도구를 선택하고 조직 표면을 가로질러 약 3mm 길이의 절제 선을 그립니다.
- 실험 목록에서 절제 라인을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 빔 직경(사용자가 적절하게 선택, 여기서는 30μm 정사각형 빔이 사용됨), 스캔 속도(초당 빔 직경의 4배, 120μm s-1) 및 에너지 플루언스(연조직의 경우 0.3 -0.5 J cm-2, 더 단단한 매트릭스의 경우 필요한 경우 최적화)를 변경하여 매개변수를 다음과 같이 설정합니다. 30μm 조직 두께에서 레이저 빔은 이 조직의 전체 두께를 관통하지 않으므로 현미경 지지대에서 잠재적인 오염 물질을 제거합니다. 탄소로 정규화하는 것은 절제된 조직의 양 변동을 보정하는 데 사용할 수 있습니다. 'default' 라디오 버튼을 선택하여 각 후속 줄에 대해 이러한 매개변수를 기본값으로 설정합니다.
- 이 줄을 6번 복제하려면 처음 줄을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 다음 '중복 스캔'을 선택합니다. 선이 빔 지름만큼 x축 또는 y축에서 오프셋되어 있는지 확인합니다. 이를 통해 표준당 총 7개의 라인이 생성되며, 빔 직경에 따라 간격이 조정됩니다.
- 각 표준에 대해 1.5.1 - 1.5.3 단계를 반복하여 동일한 길이의 선을 확인합니다.
- 샘플 위에 절제 영역을 그리려면 다음 두 가지 방법 중 하나를 따르십시오.
참고: 샘플 라인에 동일한 스캔 매개변수(빔 직경, 스캔 속도, 에너지 플루언스)가 사용되는지 확인합니다. - LA 시스템에 넓은 시야가 있는 경우 선 도구를 선택하고 1.5에 설명된 것과 동일한 레이저 매개변수를 사용하여 가장 넓은 지점에서 샘플을 덮을 수 있을 만큼 충분히 긴 샘플의 왼쪽 상단 모서리에서 선을 그립니다. 1.5.3에 설명된 대로 이 스캔을 복제하고 빔 직경에 따라 필요한 만큼 선을 배치하여 샘플의 완전한 적용 범위를 보장합니다.
- 광시야 보기를 사용할 수 없는 경우 전체 샘플을 포함하는 직사각형의 모서리에 해당하는 x 및 y 좌표(일반적으로 메인 화면에 '스테이지 위치' 또는 이와 유사한 것으로 표시됨)를 결정하고 기록합니다. 이 좌표를 사용하여 전체 시료 영역을 포함하는 절제의 평행선을 배치합니다.
- 1.5에 설명된 프로세스를 반복하여 샘플을 스캔한 ~20시간 후 늦어도 표준의 간헐적 스캔을 위한 선을 그립니다. 샘플의 스캔 시간에 따라 여러 번 필요할 수 있습니다. 표준을 추가로 스캔하여 실험을 종료합니다.
참고: 셀이 퍼지되는 동안 x 및 y 좌표를 결정할 때 홈 위치 및 축의 관련 보정을 선택하면 x 및 y 좌표에 대해 이전에 획득한 세부 사항이 변경되지만 차이(즉, 선의 길이)는 영향을 받지 않습니다.
2. ICP-MS를 위한 데이터 수집 방법 설정
- 표준 절제 라인의 경우 라인 길이를 레이저 스캔 속도로 나누어 단일 라인의 총 분석 시간을 결정합니다. 샘플 라인에 대해 이 작업을 반복합니다.
- ICP-MS 소프트웨어에서 새 분석법(여기서는 '배치'로 표시)을 생성하고 '시간 분해 분석' 또는 이와 동등한 것이 선택되었는지 확인합니다. 검출할 m/z 값을 선택한 다음 한 사이클에 대한 총 통합 시간이 0.25초가 되도록 각 m/z에 대한 통합 시간을 조정합니다. '다른 이름으로 배치 저장'을 클릭하고 그에 따라 이름을 지정합니다(예: Std1).
참고: 샘플이 빔 직경의 4배로 레이저 빔을 통과하기 때문에 각 질량에 대한 데이터 포인트가 빔 직경과 동일하게 기록됩니다. 예를 들어, 100μm 스폿 크기를 사용하면 400μm s-1의 스캔 속도와 0.25초의 통합 시간으로 실제 픽셀 크기의 이미지를 생성할 수 있습니다. 감도를 향상시키기 위해 통합 시간을 조정할 수 있습니다. 통합 시간을 0.33초로 늘리면 스캔 속도를 빔 직경의 3배로 늦춰야 합니다. - 표준의 경우 해당 상자에 각 라인 스캔에 대한 분석 시간을 입력하고 레이저 예열 및 세척 시간을 고려하여 추가로 15초를 입력합니다. 샘플 실행 목록(즉, 스캔이 실행되는 순서)을 동일한 수의 획득(일반적으로 순차적으로 번호가 매겨짐)으로 입력합니다. 즉, 001, 002 등)을 표준 라인의 총 수로 나타냅니다.
- 샘플의 경우, 현재 분석법 또는 배치를 대체 파일 이름으로 저장하여 표준에 사용된 분석법을 복제하고, 총 수집 시간(추가 15초 포함)과 총 수집 수를 샘플을 제거할 라인 수와 일치하도록 조정합니다.
참고: 대부분의 LA-ICP-MS 시스템은 단방향 트리거(LA는 ICP-MS를 트리거)를 사용합니다. ICP-MS 소프트웨어는 후속 절제 라인이 시작되기 전에 LA의 트리거를 기다리는 것이 중요합니다. ICP-MS 수집 창에 '시작 대기 중'이 표시됩니다.
3. 실험 실행:
- 첫 번째 분석법 또는 배치를 대기열에 추가하여 ICP-MS 대기열을 시작하고 소프트웨어가 LA 시스템의 트리거를 기다리고 있는지 확인합니다.
- LA 소프트웨어에서 '방출'을 클릭하여 레이저 전원 공급 장치를 활성화하고 '실행'을 클릭한 다음 해당 상자에서 레이저 예열 시간을 10초로, 세척 시간을 20초로 설정합니다.
참고: 이 오버런은 레이저가 각 후속 절제 라인을 시작할 때 ICP-MS가 새 데이터를 수집할 준비가 되었는지 확인합니다. - '시작'을 클릭하여 레이저 시퀀스를 시작합니다. 2 부피 셀을 사용하는 경우 샘플 컵이 제자리에 있는지 확인하십시오.
4. 정량 표준물질 계산
참고: ICP-MS 데이터를 이미지로 변환하는 데는 여러 가지 변형이 있습니다. 여기에는 오픈 소스 언어로 작성된 자체 제작 소프트웨어 도구, 상용 매크로 및 데이터 분석 소프트웨어의 사용이 포함됩니다. 여기에서는 특수 LA-ICP-MS 데이터 분석 제품군을 기반으로 최근에 개발된 소프트웨어 플러그인을 사용합니다.
- 실행 데이터가 포함된 모든 배치 폴더(001.d, 002.d 등)를 해석 소프트웨어가 설치된 별도의 컴퓨터로 전송합니다. 배치의 각 줄에 대한 *.csv 데이터 파일을 별도의 폴더로 추출합니다.
참고: 스크립트를 사용하여 *.csv 파일을 새 폴더로 자동으로 전송하는 것이 좋습니다. 자세한 내용은 첨부된 Python 코드를 참조하세요. 이 스크립트는 Agilent 7700 또는 8800 시리즈 ICP-MS에 적합하도록 작성되었지만 다른 제조업체의 출력 파일에 맞게 편집할 수 있습니다. - 소프트웨어 플랫폼을 열고 탭을 순차적으로 따라 표준을 가져오고 분석하여 아래 설명된 대로 정량적 이미지를 생성합니다.
- 첫 번째 표준 배치에서 데이터를 가져오려면 'File Type'에 대해 'Agilent .csv'를 선택하고 'Import type'에 대해 'Entire folder'를 선택한 다음 'Date format'이 컴퓨터 형식과 동일한지 확인합니다. '가져오기'를 클릭하고 첫 번째 표준 세트에 대한 .csv 파일이 포함된 폴더를 선택한 다음 '기준선' 탭으로 이동합니다.
- Baseline subtraction
- 도구 모음의 기본 응용 프로그램 드롭다운 메뉴에서 '자동 선택' 탭(명령 2)을 사용하여 '가져오기에서 정보'를 선택하고 '계속'을 클릭합니다.
- '모두 선택'을 클릭하고 통합을 위해 'Baseline_1'를 선택합니다.
- 각 스캔 라인의 처음 10초를 선택하려면(레이저 예열 시간에 해당) 두 번째 값 '0' 및 '(라인 기간 - 10초)'를 입력하여 데이터를 자르고 '통합 추가'를 클릭합니다(예: 35초 스캔 라인의 경우 '0' 및 '25' 값 입력).
- 샘플 데이터를 선택하려면 4.4에 설명된 대로 '자동 선택' 탭을 사용하되 통합으로 'Output_1'를 선택합니다. 배경 신호를 제외하기 위해 각 표준 라인의 시작과 끝에서 데이터를 자릅니다(예: 35초 스캔 라인의 경우 값 '13' 및 '4' 입력).
- 표준물질의 가능한 구멍으로 인해 발생하는 신호 강하를 제외하려면 '샘플' 탭에서 그래프 영역의 왼쪽 상단에 있는 '채널'을 클릭하여 신호 대 잡음비가 높은 채널(예: C13 또는 P31)을 선택합니다. 신호의 급격한 강하를 기록하고 샘플 내의 정상 변동보다 낮지만 신호의 급격한 강하를 선택할 수 있을 만큼 충분히 높은 CPS 값을 선택합니다.
- 'DRS' 탭을 클릭하고 '현재 데이터 축소 계획'에 대해 'Baseline_Subtract'를 선택합니다. 'Index Channel'에 대해 4.6 중에서 채널을 선택하고 'Threshold to use when masking low signals'에 대해 CPS 값을 선택합니다. 레이저에서 ICP-MS로의 신호 전송 지연을 설명하기 위해 '낮은 신호 전/후 트리밍 시간'에 <0.5초 값을 삽입합니다.
- 낮은 신호 영역의 적절한 마스킹을 확인하려면 '샘플' 탭으로 돌아가서 처리된(예: Fe56_CPS) 채널 트레이스를 선택합니다. 필요한 경우 4.7과 같이 CPS 및 '낮은 신호 전/후 트리밍 시간' 값을 반복하고 구체화합니다.
- 'Results' 탭을 클릭하고 기본 애플리케이션 드롭다운 메뉴에서 'Export data'를 선택합니다. 결과의 스프레드시트 데이터 파일을 생성할 파일 이름을 입력합니다(예: Std1 계산, Std2 등).
- 적절한 스프레드시트 프로그램에서 데이터 파일을 열고 정량화할 각 개별 채널의 CPS 값을 계산합니다. 용액 분무 ICP-MS에서 미리 결정된 금속 농도를 사용하여 정량화 가능한 각 원소에 대해 CPS 값에서 ppm(μg g⁻¹)으로의 변환 계수를 계산합니다.
- 실행의 모든 표준 세트에 대해 4.3 - 4.10단계를 반복합니다.
5. 정량적 이미지 구성
- 명령 프롬프트에 'Biolite()'를 입력하여 소프트웨어를 엽니다.
- 'Load Images'를 클릭하고 샘플 이미지의 .csv 파일이 포함된 폴더를 선택하여 샘플 데이터를 가져옵니다.
- 배경 보정< style='list-style-type:decimal;'>'
- 기준선' 탭을 클릭하여 샘플에 배경 보정을 적용합니다. 화면에 표시되는 인(P31) 이미지에서 사각형 그리기 도구를 사용하여 배경 영역을 선택합니다. 가능한 한 많은 영역을 선택하면 신호/플라즈마 드리프트의 이미지 전체 맵이 생성되어 이러한 교란 요인으로부터 적절한 보상을 보장할 수 있습니다.
- 배경 신호를 더 잘 보이게 하려면 그래프 편집 도구(표시된 이미지의 왼쪽 상단)를 선택하고 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 'Modify Image Appearance'를 선택하고 'First Color at Z='를 큰 음수 값(예: -100,000)으로 변경합니다. '완료'를 클릭하여 진행합니다.
'표준' 탭을 클릭하여 CPS/ppm 보정 계수에 대한 테이블을 표시합니다. 각 요소에 대해 4.10단계의 표준에서 계산된 값을 입력합니다. 이 단계는 ICP-MS의 감도 드리프트를 수정하는 데 도움이 됩니다. 'Go!' 클릭
각 요소와 각 단계에 대한 이미지가 있는 '데이터' 탭에서 '데이터 브라우저'를 엽니다.내보낼 이미지를 완성하려면 'StdCorrImages' 폴더에서 원하는 이미지를 선택하고 이미지 이름(*_ppm)을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 'NewImage'를 클릭합니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 'Modify Image Appearance'를 열고 원하는 색상표와 색상 스케일을 선택합니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 'Add Annotation'을 선택하여 이미지에 색상 스케일을 추가합니다. 왼쪽 상단 드롭다운 메뉴에서 'ColorScale'을 선택하고 탭을 사용하여 원하는 색상 스케일을 수정합니다.이미지를 내보내려면 해당 이미지가 선택되어 있는지 확인하고 '파일' 탭으로 이동하여 '그래픽 저장...'을 클릭합니다. 원하는 형식을 선택하고 이미지를 저장합니다. 또는 복사 및 붙여넣기 도구를 사용하여 선택한 이미지를 전송할 수 있습니다.관심 있는 모든 이미지에 대해 5.6단계와 5.7단계를 반복합니다.이산 영역 정량화- ROI 도구를 활성화하려면 '분석' 탭, '패키지'로 이동하여 '이미지 처리'를 선택합니다.
- 원하는 이미지를 선택하고 '이미지' 탭으로 이동하여 'ROI...'를 클릭합니다. 'ROI 그리기 시작'을 클릭하고 그리기 도구를 사용하여 샘플에서 관심 영역을 선택합니다. 그리기를 완료하려면 'ROI 완료'를 클릭합니다.
- 선택한 ROI에 대한 통계를 얻으려면 'Image' 탭으로 이동하여 'Stats...'를 클릭합니다.
- 결과를 복사하여 별도의 스프레드시트에 붙여넣습니다. 관심 있는 모든 영역과 요소에 대해 ROI 선택(5.9.2)을 반복합니다.
