방법 논문

세뇨관 결함을 연구하기 위한 쥐 모델의 2차 조화 생성 이미징

2025년 6월 17일

이 논문에서

초록

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출처: Piazza, V., et al., Label-free Non-Linear optics for the study of tubulin-dependent defects in central myelin. J. Vis. Exp. (2023)

이 비디오는 이광자 여기 현미경을 사용하여 쥐의 뇌 조직 절편에서 미세소관 이상을 이미징하는 절차를 보여줍니다. SHG(Second Harmonic Generation) 신호를 사용하여 튜불린 결함과 미엘린 생성 감소를 감지합니다.

프로토콜

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동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.

1. 현미경으로 옮기기

  1. 현미경이 다른 방에 있는 경우, 온도를 유지하면서 조직 절편을 옮길 수 있도록 데운 젤 팩이 있는 단열 상자를 준비합니다. 상자는 또한 이미지가 생성될 때까지 섹션을 따뜻하게 유지합니다.
  2. s를 놓으십시오amp현미경 아래에 놓고 투과광으로 접안렌즈를 통해 직접 관찰하여 대물렌즈 아래에 적절하게 배치되었는지 확인하십시오.
    참고: 목표는 예측된 방출 구조를 레이저의 진동 방향과 정렬하여 방출된(따라서 감지된) 2차 고조파 생성(SHG) 신호를 최대화하는 것입니다.
  3. 얇은 액체 필름이 전체 샘플을 덮도록 여분의 HBSS를 제거합니다. 샘플의 과도한 증발 및 건조를 방지하기 위해 몇 분마다 액체 필름을 육안으로 확인하십시오.
    참고: 설명된 조건에서 섹션은 20분 이상 사용되지 않습니다. 샘플을 건조시키면 급격한 인공물 효과 가 발생합니다(그림 1A). 더 긴 이미징 시간이 필요한 경우, HBSS를 더 추가하는 것보다 따뜻하고 신선한 배지에 절편을 주기적으로 담그는 것이 좋습니다. 조직을 고정시키기 위해 관류 챔버와 접착제 또는 저융점 아가로스를 사용하는 것도 더 긴 실험을 수행해야 하는 경우에도 권장됩니다.
  4. 어두운 배양실의 모든 문을 닫거나 배양실을 검은색 나일론 폴리우레탄 코팅 천으로 덮는 것을 포함할 수 있는 비스캔 이미징을 위해 현미경 스테이지를 준비합니다.

2. 이미징

  1. 전송 경로를 따라 "비보정" 이미징 모드를 선택합니다. 이러한 방식으로 튜불린의 약한 SH 신호 캡처가 최적화됩니다.
  2. LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA 대물렌즈를 선택합니다.
  3. 레이저 출력을 13mW에서 26mW 사이로 설정하고 픽셀 체류 시간을 12.6μs로 설정합니다. 512 픽셀 x 512 픽셀보다 크지 않은 이미지를 5의 속도와 평균 2의 속도로 촬영하여 평균 획득 시간은 약 15초입니다.
    참고: 더 높은 레이저 출력 및/또는 더 긴 체류 시간을 사용하면 샘플이 손상될 수 있습니다(그림 1B).
  4. 먼저 485nm 단역 통과 필터(SP485)를 사용하여 이미지를 촬영한 다음 두 번째 단계에서 선명한 405nm 대역 통과 필터(BP405; 그림 2).
    참고: 의사 명시야 이미지는 가시광선의 잔류 레이저 광을 사용하여 동일한 검출기를 통해 촬영할 수 있습니다(405nm 또는 488nm 레이저가 가장 잘 작동함).

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결과

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그림 1: 아티팩트의 예. (A) 샘플의 건조로 인한 인공물. (B) 과도한 노출로 인한 인공물. 눈금 막대 : 30 μm.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
405/10 nm BrightLine(R) 단일 대역 통과 필터SemrockFF01-405/10-2532 mm 직경, 하우징 링 포함
Black Nylon, 폴리우레탄 코팅 패브릭ThorlabsBK55' x 9'(1.5 m x 2.7 m) x 0.005"(0.12 mm) 두께
컨포칼 현미경ZeissLSM710NLO AxioObserver Z1도립 현미경, 사용된 대물렌즈는 LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA
Hanks의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)Gibco14025-076
NDD 모듈, 유형 CZeiss000000-1410-101신호를 감지하고 광 손실을 줄일 수 있습니다. SP485 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된 000000-1935-163 필터 하우징
Gibco10010-031분말 또는 탭으로 준비 가능
펄스 레이저CoherentChameleon Vision II680–1080 nm 조정 가능한 레이저
분말 로 제조하여

재인쇄 및 허가

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허가 요청

태그

SHG

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