세뇨관 결함을 연구하기 위한 쥐 모델의 2차 조화 생성 이미징

초록

출처: Piazza, V., et al., Label-free Non-Linear optics for the study of tubulin-dependent defects in central myelin. J. Vis. Exp. (2023)

이 비디오는 이광자 여기 현미경을 사용하여 쥐의 뇌 조직 절편에서 미세소관 이상을 이미징하는 절차를 보여줍니다. SHG(Second Harmonic Generation) 신호를 사용하여 튜불린 결함과 미엘린 생성 감소를 감지합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.

1. 현미경으로 옮기기

1. 현미경이 다른 방에 있는 경우, 온도를 유지하면서 조직 절편을 옮길 수 있도록 데운 젤 팩이 있는 단열 상자를 준비합니다. 상자는 또한 이미지가 생성될 때까지 섹션을 따뜻하게 유지합니다.
2. s를 놓으십시오amp현미경 아래에 놓고 투과광으로 접안렌즈를 통해 직접 관찰하여 대물렌즈 아래에 적절하게 배치되었는지 확인하십시오.
   참고: 목표는 예측된 방출 구조를 레이저의 진동 방향과 정렬하여 방출된(따라서 감지된) 2차 고조파 생성(SHG) 신호를 최대화하는 것입니다.
3. 얇은 액체 필름이 전체 샘플을 덮도록 여분의 HBSS를 제거합니다. 샘플의 과도한 증발 및 건조를 방지하기 위해 몇 분마다 액체 필름을 육안으로 확인하십시오.
   참고: 설명된 조건에서 섹션은 20분 이상 사용되지 않습니다. 샘플을 건조시키면 급격한 인공물 효과 가 발생합니다(그림 1A). 더 긴 이미징 시간이 필요한 경우, HBSS를 더 추가하는 것보다 따뜻하고 신선한 배지에 절편을 주기적으로 담그는 것이 좋습니다. 조직을 고정시키기 위해 관류 챔버와 접착제 또는 저융점 아가로스를 사용하는 것도 더 긴 실험을 수행해야 하는 경우에도 권장됩니다.
4. 어두운 배양실의 모든 문을 닫거나 배양실을 검은색 나일론 폴리우레탄 코팅 천으로 덮는 것을 포함할 수 있는 비스캔 이미징을 위해 현미경 스테이지를 준비합니다.

2. 이미징

1. 전송 경로를 따라 "비보정" 이미징 모드를 선택합니다. 이러한 방식으로 튜불린의 약한 SH 신호 캡처가 최적화됩니다.
2. LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA 대물렌즈를 선택합니다.
3. 레이저 출력을 13mW에서 26mW 사이로 설정하고 픽셀 체류 시간을 12.6μs로 설정합니다. 512 픽셀 x 512 픽셀보다 크지 않은 이미지를 5의 속도와 평균 2의 속도로 촬영하여 평균 획득 시간은 약 15초입니다.
   참고: 더 높은 레이저 출력 및/또는 더 긴 체류 시간을 사용하면 샘플이 손상될 수 있습니다(그림 1B).
4. 먼저 485nm 단역 통과 필터(SP485)를 사용하여 이미지를 촬영한 다음 두 번째 단계에서 선명한 405nm 대역 통과 필터(BP405; 그림 2).
   참고: 의사 명시야 이미지는 가시광선의 잔류 레이저 광을 사용하여 동일한 검출기를 통해 촬영할 수 있습니다(405nm 또는 488nm 레이저가 가장 잘 작동함).

결과

그림 1: 아티팩트의 예. (A) 샘플의 건조로 인한 인공물. (B) 과도한 노출로 인한 인공물. 눈금 막대 : 30 μm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
405/10 nm BrightLine(R) 단일 대역 통과 필터	Semrock	FF01-405/10-25	32 mm 직경, 하우징 링 포함
Black Nylon, 폴리우레탄 코팅 패브릭	Thorlabs	BK5	5' x 9'(1.5 m x 2.7 m) x 0.005"(0.12 mm) 두께
컨포칼 현미경	Zeiss	LSM710NLO AxioObserver Z1	도립 현미경, 사용된 대물렌즈는 LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA
Hanks의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)	Gibco	14025-076
NDD 모듈, 유형 C	Zeiss	000000-1410-101	신호를 감지하고 광 손실을 줄일 수 있습니다. SP485 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된 000000-1935-163 필터 하우징
	Gibco	10010-031	분말 또는 탭으로 준비 가능
펄스 레이저	Coherent	Chameleon Vision II	680–1080 nm 조정 가능한 레이저

분말 로 제조하여