마우스 망막 외식에서 뉴런 수지상 역학의 타임랩스 컨포칼 이미징

초록

출처: Ing-Esteves, S. & Lefebvre, J. L. 유전적으로 표적화된 망막 세포 집단의 희소 아데노 관련 바이러스 라벨링을 사용한 뉴런 수목화의 타임랩스 이미징. J. Vis. Exp. (2021)

이 비디오는 살아있는 쥐 망막 외식식물에서 수지상 역학을 시각화하기 위해 컨포칼 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 컨포칼 현미경으로 망막을 안정화하고, 별이 터진 무축삭 중간뉴런을 시각화하기 위해 에피형광 이미징을 수행하고, 무축삭 수지상 형태의 변화를 모니터링하기 위해 타임랩스 3D 이미지를 캡처하는 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 살아있는 전체 마운트 망막 준비의 타임 랩스 컨포칼 이미징

1. 그림 1.
   에서 볼 수 있듯이 직립 컨포칼 현미경을 위한 라이브 이미징 인큐베이션 챔버를 조립합니다. 참고: 반전 컨포칼 시스템의 경우, 플랫 마운트는 망막 신경절 세포(RGC) 면이 아래로 향하게 하여 인큐베이션 챔버의 유리 바닥 커버슬립에 직접 배치됩니다. 망막이 커버슬립에 닿으면 움직일 수 없습니다.
2. 산소가 공급된 인공 뇌척수액(aCSF)으로 챔버를 채우고 펌프와 온도 조절기(온도 32-34°C, 유속 1mL/분)를 켭니다. 온도가 34°C 이상으로 올라가지 않도록 하십시오.
3. 망막 플랫 마운트를 관류 챔버로 옮기려면 펌프를 중지하고 챔버에 있는 aCSF를 제거합니다. 망막 플랫 마운트가 있는 혼합 셀룰로오스 에스테르(MCE) 디스크를 (빈) 배양 챔버에 놓습니다.
4. 플랫 마운트에 샘플 무게를 놓습니다. 표면 장력을 끊기 위해 무게를 미리 적십니다. 가열된 aCSF로 챔버를 다시 채우고 ~1mL/분의 속도로 aCSF를 순환시킵니다.
5. 25x water dipping objective(개구수 0.95)가 있는 노즈피스를 이미징 챔버에 놓습니다. 에피형광을 사용하여 라벨링된 관심 세포를 스크리닝합니다(그림 1C).
6. 관심 있는 수지상 특징을 캡처하도록 이미징 볼륨을 조정합니다.
   참고: 이 연구는 프레임당 1024 x 1024 픽셀, z-단계 1μm 및 각 z-스택 간 2분의 프레임 속도로 전체 수지상 아버를 캡처했습니다. 최종 이미지 크기는 ~100μm x 100μm x 20μm입니다.
7. 레이저 출력을 최적의 설정으로 조정하려면 과포화 픽셀과 과포화 픽셀을 모두 식별하는 룩업 테이블을 사용하십시오. 스캔하는 동안 픽셀이 과포화되지 않도록(즉, 255 이상의 강도에서) 레이저 출력을 조정합니다. 필요한 경우 또는 형광 신호가 현저히 검출 가능한 감소와 노이즈가 증가할 때까지(일반적으로 2-4시간) 이미징을 계속합니다.
   참고: 픽셀이 전체 다이내믹 레인지에 분산될 때 디콘볼루션 알고리즘이 최적으로 작동하므로 레이저 출력을 줄이는 것이 좋습니다. 픽셀 강도는 254를 초과해서는 안 됩니다. 신경돌기에 대한 경험적 분석은 170 미만의 픽셀 값이 디콘볼루션에 이상적이라는 것을 보여주었습니다. 라인 평균(2-3)을 사용한 빠른 스캔 속도(400-600Hz)는 동일한 총 픽셀 체류 시간의 느린 단일 스캔보다 선호됩니다. 장시간 이미징 영역은 종종 광백백이 발생하지만 다른 외식 절편은 여전히 생존 가능합니다. 플랫 마운트의 여러 영역은 각각 2-4시간 동안 이미징할 수 있으며 총 배양 시간은 6시간입니다. 6시간 이상의 이미징 세션은 체계적으로 테스트되지 않았습니다. 신경관 분해 및 기포(blebbing)는 외식 생존력이 감소하고 있다는 신호입니다.

결과

그림 1: 라이브 셀 이미징 배양 챔버 설정. (A) 가열, 용액 및 이미징 구성 요소를 보여주는 라이브 이미징 인큐베이션 장치. 이중 히터에는 가열식 배양 챔버 플랫폼(파란색 커넥터 전극이 있는 후면 원)과 인라인 용액 히터가 포함됩니다. (B) 1A의 개략도. MCE 멤브레인(회색)의 망막 플랫 마운트(빨간색)가 배양실에 배치됩니다. 인라인 용액 히터는 용액 펌프에 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
혼합 셀룰로오스 에스테르 멤브레인(MCE) 여과지, 친수성, 0.45μm 기공 크기	Millipore	HABG01 300
폴리에틸렌 일회용 전사 피펫	VWR	470225-034
챔버 폴리에틸렌 튜브, PE-160 10'Warner	Instruments	64-0755
듀얼 채널 히터 컨트롤러, 모델 TC-344C	Warner Instruments	64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR 디핑 대물	Leica	15506374
히터 컨트롤러 케이블	Warner Instruments	CC-28
대형 욕조 배양 챔버 슬라이스 지원	Warner Instruments	RC-27L
MPII 미니 연동 펌프	Harvard Apparatus	70-2027
PM-6D 자기 가열 플랫폼(인큐베이션 챔버 히터)	Warner Instruments	PM-6D
펌프 헤드 튜빙 조각 MPII 미니 연동 펌프	Harvard Apparatus	55-4148
샘플 앵커(Harps)	워너 인스트루먼트	64-0260	샘플 앵커는 인큐베이션 챔버와 호환되어야 합니다
. Sloflo 인라인 솔루션 히터	워너 인스트루먼트	SF-28
칼슘 클로라이드 디하이드레이트	시그마-알드리치	C7902
카보겐 (5% CO₂, 95% O₂)	에어가스	X02OX95C2003102	지역에 따라 공급업체가 다를 수 있습니다
. D-(+)- 포도	시그마-알드리치	G7021
HEPES, 유리산	바이오 베이직	HB0264
염산 용액, 1 N	시그마-알드리치	H9892
염화마그네슘 육수화물	시그마-알드리치	M2670
pH-테스트 스트립 (6.0-7.7)	VWR	BDH35317.604
칼륨 염화물 (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
염화나트륨 (NaCl)	바이오 베이직	DB0483
인산나트륨 일 염기성	Sigma-Aldrich	RDD007
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	오픈 소스

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