Imaging and Quantification of Axonal Regeneration in Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons

초록

출처: Portela-Lomba, M., et. al. 성인 축삭 재생의 체외 모델로서 Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia의 공동 배양. J. Vis. 특급. (2020).

이 비디오는 불멸의 인간 후각 외피 신경교세포와 공동 배양된 축삭 절제술된 쥐 망막 신경절 뉴런(RGN)에서 축삭 재생의 이미징 및 정량화를 보여줍니다. RGN은 붉은색 솜씨와 녹색 축삭돌기가 있는 면역 표지되어 있습니다. 이미지는 epifluorescence microscope를 사용하여 캡처되었으며 축삭 및 축삭 재생 지수가 있는 뉴런의 비율은 이미징 소프트웨어를 사용하여 정량화되었습니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.

1. Human Olfactory Ensheathing Glia (ihOEG, Ts12 및 Ts14) 배양

참고: 이 절차는 조직 배양 생물 안전성 캐비닛에서 멸균 상태로 수행됩니다.

1. 50mL ME10 OEG 배양 배지를 준비합니다.
2. 15mL 원뿔형 튜브에 Dulbecco의 Modified Eagle 배지 또는 DMEM/F12-Fetal Bovine Serum(FBS) 5mL를 준비합니다.
3. 두 매체를 37°C의 깨끗한 수조에서 15분 동안 가열합니다.
4. 깨끗한 수조에서 37°C의 Ts12 및 Ts14 셀 바이알을 해동합니다.
5. 2단계에서 준비한 DMEM/F12-FBS 배양 배지에 세포를 재현탁하고 추가합니다.
6. 200 x g에서 5분 동안 원심분리기를 합니다.
7. 상층액을 흡인합니다.
8. 500μL의 ME10 배지를 추가하고 펠릿을 재현탁합니다.
9. 3mL의 ME10이 함유된 p60 세포 배양 접시를 준비하고 세포 현탁액을 적가합니다.
10. 플레이트에 걸쳐 셀을 균일하게 분배하려면 이동합니다.
11. 37°C에서 5% CO₂로 세포를 배양합니다.
    참고: 합류점에 도달한 후, 공동 배양을 위해 세포를 최적화하기 위해 최소한 다른 통로를 수행해야 합니다. 공동 배양을 위해 커버 슬립에 파종하기 전에 90 % 합류가 필요합니다. confluent p-60의 평균 세포 수는 Ts14의 경우 7 x 10⁵이고 Ts12 세포주의 경우 2.5 x 10⁶입니다. Ts12 및 Ts14 세포주는 2-3일마다 계대배양해야 합니다.

2. 분석을 위한 ihOEG(Ts12 및 Ts14) 준비

참고: 이 단계는 망막 신경절 뉴런(RGN) 해부 및 공동 배양 24시간 전에 수행해야 합니다.

1. 12mm Ø 커버슬립을 10μg/mL 폴리-L-라이신(PLL)으로 1시간 동안 처리합니다.
   참고: 커버슬립은 PLL 용액에 밤새 방치할 수 있습니다.
2. 1x 인산염 완충액 식염수(PBS)로 커버슬립을 세 번 세척합니다.
3. p60 세포 배양 접시에서 Ts12 및 Ts14 ihOEG 세포를 분리합니다.
   1. 15mL 코니컬 튜브에 4mL의 DMEM/F12-FBS 배양 배지를 추가합니다. 깨끗한 수조에서 37 °C로 데우십시오.
   2. 플레이트에서 매체를 제거하고 1x PBS-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 1mL로 세포를 한 번 세척합니다.
   3. OEG 세포에 트립신-EDTA 1mL를 추가하고 37°C, 5% CO₂에서 3-5분 동안 배양합니다.
   4. p1000 피펫으로 세포를 수집하고 3.1단계에서 준비한 배지로 옮깁니다.
   5. 200 x g에서 5분 동안 원심분리기를 합니다.
   6. 상층액을 흡인합니다.
   7. ME10 배지 1mL를 추가하고 펠릿을 재현탁합니다.
   8. 혈구계에서 세포 수를 세십시오.
4. 80,000 Ts14 세포 또는 100,000 Ts12 세포/웰을 500 μL의 ME10 배지에서 24-well 플레이트의 커버슬립에 시딩합니다.
5. 37°C에서 5% CO₂에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.

3. 망막 조직 박리

참고: 생후 2개월 된 수컷 Wistar 쥐가 RGN 소스로 사용됩니다. 24웰 세포 접시의 20웰에 대한 2개의 망막(쥐 1마리). 사용하기 전에 수술 재료를 오토클레이브하십시오. 파파인 해리 키트는 상업적으로 구매됩니다(재료 표). 재구성을 위해 공급자의 지침을 따릅니다. D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid (APV)를 5 mM stock에서 재구성하고 부분 표본을 준비합니다.

1. 분석 당일에는 다음 배지를 준비합니다.
   1. 차가운 Earle's Balanced Salt Solution 또는 EBSS(파파인 해리 키트의 바이알 1) 5mL와 함께 p60 세포 배양 접시를 준비합니다.
   2. 파파인 해리 키트의 재구성된 바이알 2(파파인)와 50μL의 APV가 포함된 p60 세포 배양 접시를 준비합니다. 그런 다음 250μL의 재구성된 바이알 3(DNase와 5μL의 APV)을 추가합니다.
   3. 멸균 튜브에서 2.7mL의 바이알 1과 300μL의 바이알 4(알부민-오보뮤코이드 프로테아제 억제제)를 혼합합니다. 150μL의 바이알 3(DNase)과 30μL의 APV를 추가합니다.
   4. Neurobasal-B27 배지(NB-B27) 20mL를 준비합니다.
2. CO₂로 쥐를 질식시켜 희생시킵니다.
3. 단두대로 참수하여 머리를 제거하십시오. 100mm 페트리 접시에 넣고 머리에 70% 에탄올을 뿌린 후 층류 후드에 넣습니다.
4. 쥐의 수염을 가위로 잘라 눈 조작을 방해하지 않도록 합니다.
5. 겸자로 시신경을 잡고 메스로 눈을 절개할 수 있을 만큼 안구를 빼냅니다.
6. 수정체와 유리체액을 제거하고 망막(주황색 조직)을 빼내고 나머지 눈의 층(색소 상피층 포함)은 내부에 남아 있습니다.
7. 3.1.1단계에서 준비한 p60 세포 배양 접시에 망막을 놓습니다.
8. 3.1.2단계에서 준비한 p60 세포 배양 접시에 망막을 옮기고 메스로 약 1mm 크기의 작은 조각< 자릅니다.
9. 15mL 플라스틱 튜브에 옮깁니다.
10. 37°C의 가습 인큐베이터에서 5% CO₂에서 10분마다 교반하면서 조직을 30분 동안 배양합니다.
11. 유리 파스퇴르 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 세포 덩어리를 해리합니다.
12. 세포 현탁액을 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
13. 상층액을 버리고 파파인을 비활성화하기 위해 3.1.3단계에서 준비한 용액에 세포 펠렛을 재현탁합니다. (2 개의 눈을위한 1.5 mL).
14. 이 세포 현탁액을 5mL의 재구성된 바이알 4에 조심스럽게 피펫팅합니다.
15. 200 x g에서 5분 동안 원심분리기.
16. 원심분리 중 OEG 24웰 세포 플레이트(이전에 2단계에서 준비)에서 ME-10 배지를 완전히 제거하고 웰당 500μL의 NB-B27 배지로 교체합니다.
17. 상등액을 버리고 NB-B27 배지 2mL에 세포를 재현탁합니다.
18. m24 플레이트의 웰당 100μL의 망막 세포 현탁액을 PLL 처리 또는 OEG 단층 커버슬립에 플레이트합니다.
19. NB-B27 배지에서 96시간 동안 5% CO₂로 37°C에서 배양을 유지합니다.

4. 면역염색

1. 96시간 후 배양액(600μL)에 동일한 부피의 1x PBS에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 첨가하여 10분 동안 세포를 고정합니다(PFA 최종 농도 2%).
2. 24-멀티웰 플레이트에서 배지와 PFA를 제거하고 1x PBS에 500μL의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 다시 한 번 첨가합니다. 10분 동안 배양합니다.
3. 정착액을 버리고 5분 동안 1x PBS로 3회 세척합니다.
4. PBS(PBS-TS)에서 0.1% Triton X-100/1% FBS로 30-40분 동안 차단합니다.
5. 다음과 같이 PBS-TS 완충액에 1차 항체를 준비합니다: SMI31(MAP1B 및 NF-H 단백질에 대한) 단클론 항체(1:500). 514 (MAP2A 및 B 단백질 인식) 토끼 다클론 항혈청 (1:400).
6. 공동 배양에 1차 항체를 추가하고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
7. 다음날 항체를 버리고 5분 동안 1x PBS로 커버슬립을 3회 세척합니다.
8. 다음과 같이 PBS-TS 버퍼에 2차 항체를 준비합니다: SMI-31의 경우 마우스 방지 Alexa Fluor 488(1:500). 514의 경우 토끼 방지 Alexa-594(1:500).
9. 해당 형광 2차 항체로 세포를 실온에서 1시간 동안 또는 어두운 곳에서 RT로 배양합니다.
10. 어둠 속에서 1x PBS로 커버 슬립을 3 회 5 분 동안 세탁하십시오.
11. 마지막으로, 장착 매체(Table of Materials)로 커버슬립을 장착하고 4°C로 유지합니다.
    참고: 필요할 때마다 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)를 사용한 형광 핵 염색을 수행할 수 있습니다. 장착하기 전에 DAPI(1x PBS에서 10μg/mL)를 사용하여 어두운 곳에서 10분 동안 세포를 배양합니다. 3x PBS로 커버슬립을 1회 세척하고 마지막으로 장착 매체로 커버슬립을 장착합니다.

5. 축삭 재생 정량화

참고: 샘플은 상피 형광 현미경의 40x 대물렌즈로 정량화됩니다. 각 처리에 대해 정량화하기 위해 최소 200개의 뉴런이 있는 무작위 필드에 대해 최소 30장의 사진을 촬영해야 합니다. 각 실험은 최소 3회 반복해야 합니다.

1. 전체 RGN 집단(신경세포체 및 수상돌기의 MAP2A/B 514 양성 면역염색으로 식별됨)과 관련하여 축삭돌기(SMI31 양성 중성석)가 있는 뉴런의 비율을 정량화합니다.
2. 축삭 재생 지수 또는 평균 축삭 길이(μm/뉴런)를 정량화합니다. 이 매개변수는 식별된 모든 축삭돌기의 길이(μm)의 합으로 정의되며, 축삭돌기가 있는지 여부에 관계없이 계산된 뉴런의 총 수로 나뉩니다. 축삭 길이는 이미지 소프트웨어 ImageJ(NIH-USA)의 플러그인 NeuronJ를 사용하여 결정됩니다.
3. 적절한 소프트웨어를 사용하여 평균, 표준 편차 및 통계적 유의성을 계산합니다.

재료