전반사(Total Internal Reflection) 형광 현미경을 사용한 세포 이미징

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Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

출처: Daniele, F., et. SH-SY5Y 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 평가하기 위한 al TIRFM 및 pH 민감성 GFP 프로브: 세포 이미징 및 데이터 분석. J. Vis. 특급. (2015).

이 동영상은 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용하여 형광단 태그가 지정된 시냅스 소포를 시각화하는 인간 신경모세포종 세포의 이미징을 보여줍니다. 세포는 먼저 형광 모드에서 초점을 맞춥니다. 그런 다음 내부 전반사를 달성하기 위해 조정이 이루어지며, 멤브레인 근처의 형광단을 선택적으로 여기시키는 소멸파를 생성합니다. TIRF 이미징 전에 획득 매개변수가 구성되고 샘플링 주파수가 설정됩니다.

Protocol

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1. 세포 배양 및 형질주입

SH-SY5Y 세포 배양
참고: 실험은 인간 신경모세포종 SH-SY5Y(ATCC# CRL-2266)를 사용하여 수행되었습니다. SH-SY5Y 세포는 부유 클러스터와 부착 세포의 혼합물로 성장합니다. 프로토콜에 보고된 지침(세포 밀도, 분할 비율 등)에 따라 자라는 세포가 유리 덮개에 단단히 부착되도록 하며, 이는 전반사 형광 현미경(TIRFM)에 매우 중요합니다.
1. 시작하기 전에 층류 생물 안전 캐비닛 아래에서 멸균 인산염 완충액 식염수(PBS) 용액과 배양 배지의 적절한 양을 만드십시오.
  1. 150mM 염화나트륨(NaCl) 농도, 24mM 인산염 완충액, pH 7.4의 PBS 50ml를 만듭니다. 용액을 필터링합니다.
  2. 고포도당, 10% 열 불활성화 소 태아 혈청(FBS), 페니실린(100 U/ml), 스트렙토마이신(100 μg/ml), L-글루타민(2 mM) 및 피루브산 나트륨(1 mM)을 함유한 Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM)로 50ml의 세포 배지를 만듭니다. 용액을 필터링합니다.
2. 완전한 성장 배지를 제거하고 P....

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Results

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그림 1. TIRF 현미경 설정. TIRF 현미경 시스템의 개략도 및 이미지(삽입). 설정은 Axio Observer Z1 전동 도립 현미경(A), 다중 라인 100mW 아르곤 이온 레이저(B) 및 TIRF 슬라이더(C)로 구성됩니다. 레이저 광(녹색 선)과 백색광(황색 선)이 표시됩니다. 세포는 100 × 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 이미지화됩니다. 디지털 이미지는 냉각된 RetigaSRV 고속 CCD 카메라에서 캡처됩니.......

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List of materials used in this article

Name

Company

Catalog Number

Comments

Equipment

Axio Observer Z1

Zeiss

491912-9850-000

inverted microscopehttp://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction

Multiline Argon Laser Lasos 77