전반사(Total Internal Reflection) 형광 현미경을 사용한 세포 이미징

Abstract

출처: Daniele, F., et. SH-SY5Y 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 평가하기 위한 al TIRFM 및 pH 민감성 GFP 프로브: 세포 이미징 및 데이터 분석. J. Vis. 특급. (2015).

이 동영상은 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용하여 형광단 태그가 지정된 시냅스 소포를 시각화하는 인간 신경모세포종 세포의 이미징을 보여줍니다. 세포는 먼저 형광 모드에서 초점을 맞춥니다. 그런 다음 내부 전반사를 달성하기 위해 조정이 이루어지며, 멤브레인 근처의 형광단을 선택적으로 여기시키는 소멸파를 생성합니다. TIRF 이미징 전에 획득 매개변수가 구성되고 샘플링 주파수가 설정됩니다.

Protocol

1. 세포 배양 및 형질주입

1. SH-SY5Y 세포 배양
   참고: 실험은 인간 신경모세포종 SH-SY5Y(ATCC# CRL-2266)를 사용하여 수행되었습니다. SH-SY5Y 세포는 부유 클러스터와 부착 세포의 혼합물로 성장합니다. 프로토콜에 보고된 지침(세포 밀도, 분할 비율 등)에 따라 자라는 세포가 유리 덮개에 단단히 부착되도록 하며, 이는 전반사 형광 현미경(TIRFM)에 매우 중요합니다.
   1. 시작하기 전에 층류 생물 안전 캐비닛 아래에서 멸균 인산염 완충액 식염수(PBS) 용액과 배양 배지의 적절한 양을 만드십시오.
      1. 150mM 염화나트륨(NaCl) 농도, 24mM 인산염 완충액, pH 7.4의 PBS 50ml를 만듭니다. 용액을 필터링합니다.
      2. 고포도당, 10% 열 불활성화 소 태아 혈청(FBS), 페니실린(100 U/ml), 스트렙토마이신(100 μg/ml), L-글루타민(2 mM) 및 피루브산 나트륨(1 mM)을 함유한 Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM)로 50ml의 세포 배지를 만듭니다. 용액을 필터링합니다.
   2. 완전한 성장 배지를 제거하고 PBS 3ml로 세포를 씻습니다.
   3. 0.05% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 2ml(6cm 페트리 접시용)로 37°C, 5% CO₂에서 5분 동안 세포를 배양하고 피펫을 사용하여 세포를 분리합니다.
   4. DMEM 2ml를 첨가하여 트립신을 비활성화하고 300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다.
   5. 상층액을 제거하고, 펠릿에 DMEM 1ml를 첨가하고, 세포를 단일 세포 현탁액으로 분산시킬 수 있도록 용액을 위아래로 피펫팅합니다.
   6. 완전한 배지 3ml가 들어 있는 직경 6cm의 새로운 페트리 접시에 1:4로 나눕니다. 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C의 직경 6cm의 페트리 접시에 배양 중인 세포를 유지합니다. 일주일에 한 번 또는 표면적의 80-90%를 덮었을 때 하위 배양.
2. 이미징을 위한 SH-SY5Y 세포 도금
   1. TIRFM 실험의 경우 플레이트 셀을 유리 덮개에 놓습니다. 0.17 ± 0.005 mm 두께와 1.5255 ± 0.00015 굴절률의 유리 커버를 사용합니다. 시작하기 전에 다음과 같이 유리 커버 슬립을 준비하십시오 :
      1. 90 % 에탄올로 유리 커버를 밤새 청소하십시오 (O / N).
      2. 증류수로 철저히 헹굽니다(증류수 3회 변경). 건조 오븐에 마른 유리 덮개를 씌웁니다.
      3. 유리 페트리 접시에 덮개를 놓고 200°C로 예열된 오븐에서 3시간 동안 살균합니다.
   2. transfection 전날, 각 커버슬립을 3.5cm 페트리 접시에 넣고 배양 배지 1ml를 추가한 다음 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다.
   3. 1.1.3 - 1.1.5 단계에 설명된 대로 세포를 트립신화하고, 1ml의 완전한 배지에 세포 펠릿을 현탁시킨 다음 계수합니다. 각 페트리 접시에 추가할 세포 현탁액의 정확한 부피를 계산하여 3 x 10⁵ 세포/웰을 산출합니다. 이 밀도는 최적의 세포 성장과 효율적인 transfection에 필요합니다. 37 ° C에서 5 % CO₂ 인큐베이터 O / N으로 배양합니다.
3. 폴리에틸렌이민(PEI)에 의한 SH-SY5Ytransfection
   참고: 시냅스 소포 역학을 시각화하기 위해 synapto-pHluorin을 포함하는 pCB6 벡터가 사용되었습니다. synapto-pHluorin은 녹색 형광 단백질(GFP)의 pH에 민감한 변이체와 소포막 단백질 synaptobrevin 2의 프레임 내 융합에 의해 생성되었습니다. 이 구조는 뉴런 내의 시냅스 소포 특성을 조사하기 위해 광범위하게 사용되었습니다.
   1. 트랜스펙션을 시작하기 전에 다음 용액 10ml를 만드십시오. 솔루션을 최대 1개월 동안 보관하십시오.
      1. 150mM NaCl 용액을 만듭니다. 0.01N 염산(HCl)으로 pH 5.5로 조정합니다.
      2. 150mM NaCl 용액에서 10% 폴리에틸렌이민(PEI, 25kDa 선형)으로 PEI 용액을 만듭니다. 용액의 pH는 8.8로 상승합니다. 0.01N HCl로 pH를 7.8로 조정합니다.
   2. 도금 후 24시간 후에 배지를 제거하고 1.5ml의 완전한 배지로 새로 고칩니다. 5% CO₂ 인큐베이터에서 셀을 37°C로 유지합니다.
   3. 층류 생물 안전 캐비닛 아래의 1.5ml 마이크로분리 튜브에 3.5cm 페트리 접시당 25μl의 150mM NaCl 용액과 100μl의 PEI 용액에 3μg의 플라스미드 DNA를 추가합니다.
   4. 10초 동안 Vortex를 사용한 다음 DNA/PEI 혼합물을 실온(RT)에서 30분 동안 배양합니다.
   5. 세포가 있는 커버슬립이 들어 있는 페트리 접시에 DNA/PEI 혼합물을 조심스럽게 넣고 부드럽게 흔들어 페트리 접시에 시약을 균등하게 분배합니다.
   6. 4 시간 후, 배지를 변경하고 5 % CO₂ 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포 O / N을 배양합니다. transfection 후 24 - 48시간 후에 이미징 실험을 수행합니다.

2. TIRFM을 통한 세포 이미징

1. 이미징 설정
   1. 그림 1에 설명된 설정으로 TIRF 이미징을 수행합니다. 전동 도립 현미경(그림 1, 삽입 A), 레이저 소스(그림 1, 삽입 B) 및 TIRF 슬라이더(그림 1, 삽입 C)로 구성됩니다. 높은 개구수(NA 1.45 Alpha Plan-Fluar) 100X 오일, 침지 대물렌즈를 통해 TIRFM 조명에 도달합니다.
   2. TIRFM 조명의 경우 다중 라인(458/488/514nm) 100mW 아르곤 이온 레이저를 사용합니다. 모노 모드 광섬유를 사용하여 TIRF 슬라이더를 통해 선형 편광된 레이저 광을 빔 경로에 도입합니다. TIRF 슬라이더를 반사광 빔 경로의 발광장 다이어프램 평면에 삽입합니다.
      1. 광시야 조명의 경우 현미경을 기존의 수은 단호 램프 HBO 백색광에 연결하십시오. 슬라이더의 편광 유지 이중 프리즘은 TIRF 조명과 백색광의 동시 결합을 보장합니다.
   3. 필터 휠에 장착된 여기 필터(대역폭 488/10nm)로 레이저 광을 필터링하고 레이저 경로에 도입합니다. 소프트웨어로 제어되는 고속 셔터를 사용하여 레이저 조명을 빠르게 제어할 수 있습니다. 플루오린 분석의 경우 대역통과 525/50nm 방출 필터를 장착합니다. Image ProPlus 소프트웨어를 사용하여 냉각된 고속 CCD 카메라에서 디지털 이미지(512 x 512 픽셀)를 캡처할 수 있습니다.
2. TIRF 조명 달성(그림 2)
   1. 레이저, 컴퓨터, 카메라, 필터 휠 및 셔터 컨트롤러를 켭니다. 그런 다음 레이저가 예열되고 안정화되어야 하므로 실험을 시작하기 전에 20분 동안 기다립니다.
   2. 이미징하기 전에 다음 솔루션의 적절한 볼륨을 만드십시오.
      1. 125mM NaCl, 5mM 염화칼륨(KCl), 1.2mM 황산마그네슘(MgSO₄), 1.2mM 인산이수소칼륨(KH₂PO₄), 25mM 4-(2-하이드록시에틸) 피페라진-1-에탄술폰산(HEPES)(pH 7.4로 완충), 2mM 염화칼슘(CaCl₂) 및 6mM 포도당에서 50ml의 크렙스(KRH) 용액을 만듭니다.
      2. 80 mM NaCl, 50 mM KCl, 1.2 mM MgSO₄, 1.2 mM KH₂PO₄, 25 mM HEPES (pH 7.4로 완충), 2 mM CaCl₂ 및 6 mM 포도당에서 10 ml의 KCl-KRH 용액(pH 7.4)을 만듭니다.
   3. 형질 주입된 세포가 있는 유리 덮개를 제거하고 적절한 이미징 챔버에 삽입합니다. 챔버를 조립하고 유리 중앙에 KRH 용액 500μl를 추가합니다.
   4. 대물렌즈 위에 기름을 바르십시오. 이미징 챔버를 s에 놓습니다.tage 현미경의 및 유리 커버슬립 아래에 대물렌즈를 배치합니다. 샘플 위에 안전 덮개를 놓습니다.
   5. epifluorescence 모드에서는 coverslip(상부 표면)에 초점을 맞추고 챔버 중앙에 배치된 형질 주입된 세포를 선택합니다. 80msec 미만의 노출 시간을 사용하여 형광 신호를 명확하게 기록할 수 있는 세포를 선택합니다.
   6. 소프트웨어 제어에서 라이브 모드에서 TIRF 조명으로 전환합니다.
   7. TIRF 구성을 설정하려면 샘플 커버의 대물렌즈에서 나오는 빔의 위치를 확인하십시오(그림 2B). 빔이 대물렌즈의 중앙에 위치할 때(그림 2A, 왼쪽), TIRF 샘플 커버의 중앙에 반점이 보이고(그림 2B, 왼쪽), 세포는 상피 형광 모드(여러 초점 평면, 높은 배경 형광; 그림 2C, 왼쪽).
   8. 임계각에 도달하려면 초점이 맞춰진 지점을 Y 방향(앞으로 또는 뒤로; 그림 2B, 중앙) TIRF 슬라이더의 각도 조정 나사를 사용합니다(그림 1C). 빔이 임계각보다 큰 각도로 샘플 평면에 수렴하면(그림 2A, 오른쪽), 스폿이 사라지고 샘플 커버 중간에 직선적이고 얇은 초점이 맞춰진 선이 분명합니다(그림 2B, 오른쪽).
   9. TIRF 각도를 미세 조정하려면 셀 샘플을 사용하십시오(그림 2C). 비디오에서 형광 이미지를 시청하십시오. 이 단계에서는 epifluorescence와 같은 이미지를 계속 볼 수 있습니다. TIRF 조건이 달성될 때까지 나사를 부드럽게 움직입니다: 셀의 하나의 광학 평면만 초점이 맞춰집니다(즉, 커버슬립과 접촉하는 원형질막). 그 결과 콘트라스트가 높은 평면 이미지가 생성됩니다(그림 2C, 오른쪽).
3. 샘플 이미징
   1. 단일 채널 타임랩스 실험을 설정합니다. 광표백을 최소화하려면 낮은 노출 시간과 높은 게인을 사용하여 이미지를 캡처합니다. 적절한 노출 시간은 40 - 80 msec 사이입니다. 1 - 2Hz 샘플링 주파수에서 이미지를 획득합니다. 소포 동역학은 더 높은 주파수(10Hz)에서 샘플링하는 것이 더 좋을 수 있습니다. 규칙적인 관찰 시간은 일반적으로 2분입니다.

Results

그림 1. TIRF 현미경 설정. TIRF 현미경 시스템의 개략도 및 이미지(삽입). 설정은 Axio Observer Z1 전동 도립 현미경(A), 다중 라인 100mW 아르곤 이온 레이저(B) 및 TIRF 슬라이더(C)로 구성됩니다. 레이저 광(녹색 선)과 백색광(황색 선)이 표시됩니다. 세포는 100 × 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 이미지화됩니다. 디지털 이미지는 냉각된 RetigaSRV 고속 CCD 카메라에서 캡처됩니...

Materials