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1. TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 통한 엑소 사이크 이벤트 이미징
참고: 이 프로토콜에는 온도, 습도 및 이산화탄소(CO2)를 유지하기 위한 환경 챔버, 반광 조명이 장착된 거꾸로 된 내부 반사 형광(TIRF) 현미경, 고배율/고개구수(NA) TIRF 대물렌즈, 자동화된 XYZ 스테이지 및 민감한 전하 결합 소자(CCD) 검출기. 이 프로토콜은 100x 1.49 NA TIRF 대물렌즈, 솔리드 스테이트 491 nm 레이저 및 전자 증식 CCD(EM-CCD)가 장착된 완전 자동화된 반전 현미경을 사용합니다. 모든 장비는 이미징 및 레이저 제어 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 이미징 프로토콜을 시작하기 전에 환경 챔버, 스테이지, 램프, 컴퓨터 및 카메라의 전원을 켭니다.
- 이미징 소프트웨어 내에서 대물렌즈를 선택합니다. 대물렌즈가 제자리에 있으면 대물렌즈 히터를 칼라 주위에 고정합니다.
스테이지 - 인큐베이터를 스테이지 슬롯에 고정하기 전에 대물렌즈가 완전히 내려갔는지 확인하십시오. 유출을 방지하기 위해 증류수를 스테이지 인큐베이터 입구에 고르게 붓습니다.
- 배양 시스템을 켭니다. CO2 탱크의 밸브를 열고 제조업체의 지침에 따라 압력이 시스템에 적합한지 확인하십시오. 챔버가 5% CO2 및 37°C에 도달할 때까지 잠시 기다리십시오. 이미징 접시를 추가하기 전에 대물렌즈에 물이 응결되지 않도록 인큐베이터에 빈 접시를 놓습니다.
- 레이저 소스의 전원을 켭니다.
- 스테이지 인큐베이터를 열고 렌즈에 침지 오일을 추가합니다. 샘플을 인큐베이터에 넣고 안정성 암 또는 접시 추로 안정화합니다. 오일이 샘플 바닥에 닿을 때까지 대물렌즈를 올립니다. 투과광 조명으로 전환하고 안경을 통해 신경 초점면을 찾습니다.
- 레이저 소프트웨어를 시작하고 레이저 제어 소프트웨어에 연결합니다. 조명을 광시야로 설정하고 대물렌즈를 선택합니다(100x 1.49 NA TIRF 권장). 샘플의 굴절률(셀 ~1.38)을 설정합니다. 491nm 레이저에 대해 "TTL"(트랜지스터-트랜지스터 로직)을 선택 취소하여 레이저 강도를 조정합니다. 슬라이더를 100으로 조정한 다음 다시 20%에서 40% 사이의 값으로 낮춥니다. "TTL"을 다시 확인하십시오.
- 투과광 조명에서 샘플에 다시 초점을 맞춥니다. 이미징 소프트웨어로 이동하여 491nm 레이저 조명을 선택하고 셔터를 엽니다. 천장에 있는 레이저의 초점을 미세 조정하고 콘덴서를 제거한 상태에서 폐쇄 필드 다이어프램의 중앙에 배치합니다. 렌즈가 긁히지 않도록 콘덴서를 광학 벤치에 거꾸로 놓습니다.
- 콘덴서를 교체하고 TIRF 소프트웨어로 이동하여 침투 깊이(PD)를 110nm로 설정합니다. 그런 다음 이미징을 위해 광시야 조명에서 TIRF 조명 모드로 전환합니다.
- 소포 관련 막 단백질 2(VAMP2)-플루오린 발현 세포를 접시 형광 광원과 함께 광시야 낙현형광을 사용하여 안구를 통해 세포를 찾습니다.
- 최소 노출 시간과 레이저 강도를 사용하여 이미징 매개변수(노출 시간, 게인 및 레이저 출력)를 조정하여 신호 대 잡음비 및 다이내믹 레인지를 최대화하여 광표백 및 광독성을 줄입니다(예: 50 - 100msec 사이의 노출, 30% 최대 레이저 출력에서 15 - 30 게인
).- 셀당 연속 자동 초점을 설정합니다. 5분 동안 0.5초마다 획득이 발생하는 타임랩스 이미지 세트를 획득합니다. netrin-1 자극 조건의 경우, 층류 후드의 세포 접시에 500ng/ml netrin-1을 첨가하고 이미징하기 전에 접시를 인큐베이터에 1시간 동안 되돌립니다.