엑소 세포 사건의 시각화를 위한 전반사 형광 현미경

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

출처: Winkle, CC, et al. 축삭 분지 및 신경 형태 형성 동안 원형질막 전달의 역할을 정의하기 위해 결합된 방법론을 활용합니다. J. Vis. 경험. (2016년)

이 비디오는 피질 뉴런의 엑소 사이크 이벤트를 시각화하기 위한 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 보여줍니다. pH에 민감한 녹색 형광 단백질(GFP) 마커는 소포 융합 시 형광을 발하며, 선택적 TIRF 여기는 타임랩스 이미징에서 막-근위 엑소사이토시스를 포착합니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 통한 엑소 사이크 이벤트 이미징

참고: 이 프로토콜에는 온도, 습도 및 이산화탄소(CO₂)를 유지하기 위한 환경 챔버, 반광 조명이 장착된 거꾸로 된 내부 반사 형광(TIRF) 현미경, 고배율/고개구수(NA) TIRF 대물렌즈, 자동화된 XYZ 스테이지 및 민감한 전하 결합 소자(CCD) 검출기. 이 프로토콜은 100x 1.49 NA TIRF 대물렌즈, 솔리드 스테이트 491 nm 레이저 및 전자 증식 CCD(EM-CCD)가 장착된 완전 자동화된 반전 현미경을 사용합니다. 모든 장비는 이미징 및 레이저 제어 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 이미징 프로토콜을 시작하기 전에 환경 챔버, 스테이지, 램프, 컴퓨터 및 카메라의 전원을 켭니다.

이미징 소프트웨어 내에서 대물렌즈를 선택합니다. 대물렌즈가 제자리에 있으면 대물렌즈 히터를 칼라 주위에 고정합니다.
인큐베이터를 스테이지 슬롯에 고정하기 전에 대물렌즈가 완전히 내려갔는지 확인하십시오. 유출을 방지하기 위해 증류수를 스테이지 인큐베이터 입구에 고르게 붓습니다.
배양 시스템을 켭니다. CO₂ 탱크의 밸브를 열고 제조업체의 지침....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm 유리 바닥 라이브 셀 이미징 접시	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	를 도금하기 전에 1mg/mL 폴리-D-라이신으로 코팅하고 헹구어야 합니다
Olympus IX81-ZDC2 도립 현미경	Olympus
람다 LS 크세논 램프	Sutter Instruments Company
환경 스테이지 탑 인큐베이터	Tokai Hit
100x 1.49 NA TIRF 대물렌즈	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Cell TIRF 제어 소프트웨어	Olympus		제어에 사용되는 소프트웨어 TIRF 이미징용 레이저
피지(이미지 J)	NIH	ImageJ 버전 1.49t
토끼 다클론 항인간 VAMP2	세포 신호 전달	11829
Poly-D-lysine	Sigma	p-7886	멸균수에 1mg/mL로 용해

세포.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission