3차원 이미징을 통한 뇌 절편의 실시간 유전자 발현 모니터링

초록

출처: Shimojo, H., et al. 쥐 신경 발생 중 노치 신호 전달 역학의 실시간 생물 발광 이미징. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오에서는 형질전환 마우스 배아의 피질 절편 배양을 사용하여 3차원 이미징을 통해 유전자 발현을 모니터링합니다. 생물발광, 형광 및 명시야 이미지는 천연 조직 내에서 신경 분화 동안 실시간 유전자 발현을 시각화하는 데 사용됩니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 적절한 동물 윤리 검토 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다.

1. 슬라이스 배양에서 루시페라아제 리포터 발현의 시각화
   해
   1. 부를 시작하기 전에 발광 라이브 이미징 시스템을 시작합니다. 피질 절편 배양에는 40% O₂, 5 % CO₂ 및 37 °C 조건을 사용하십시오.
   2. 40x 대물 렌즈에 침지 오일을 바르십시오. 샘플 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다. 형광 테스트 이미지를 획득하고 여기 조명 조명 하에서 관심 영역에 위치와 초점 평면을 설정합니다.
   3. 24시간 동안 3차원(발광, 형광 및 명시야) 획득에 의한 타임랩스 획득을 실행합니다(그림 1F-H). 발광 이미지 획득의 경우 낮은 전송 속도(50kHz), 2x2/4x4 비닝, 10분/5분 노출 시간 등의 카메라 설정을 사용하십시오. 형광 및 명시야 이미지 획득의 경우 중간 전송 속도(1MHz), 1x1 비닝 및 100ms 노출 시간 설정을 사용합니다.

결과

그림 1: 배아 종뇌의 피질 절편을 만들고 피질 절편 배양에서 Dll1 단백질 역학을 시각화합니다. (A) 형광 입체 현미경을 이용하여 EGFP의 발현을 확인하는 단계. 빨간색 화살표는 EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)를 발현하는 피질 영역을 나타냅니다. 좌반구(a), 우반구(b), 중뇌(c). (

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
냉각수 순환기(냉각기)	Julabo	모델: F12-ED
냉각 CCD 카메라	Andor Technology	모델: iKon-M 934
인큐베이터 시스템	TOKAI HIT	모델: INU-ONICS
도립 현미경	올림푸스	모델: IX81
도립 현미경	올림푸스	모델: IX83
LED 조명 장치	CoolLED	모델: pE1
MetaMorph	MOLECULAR DEVICES	모델: 40000
혼합 가스 컨트롤러	Tokken	모델: TK-MIGM OLO2
대물 렌즈	올림푸스	모델: UPLFLN 40X O