닭 배아의 신경망 및 혈관망 시각화

초록

출처: Delalande, J., et.al. 병아리^GFP 신경관 이식 및 카보시아닌 염료 DiI 주사를 사용한 닭 배아 내 신경능선 세포와 혈관의 이중 표지. J. Vis. 경험. (2015년)

이 비디오는 단계 일치 형질전환 닭 배아에서 1 내지 7 체절 수준에서 수혜자 배아로 GFP 표지 기증자 신경관을 이식한 후 친유성 형광 염료를 사용하여 혈관 라벨링하는 방법을 보여줍니다. 결합된 접근 방식을 통해 입체 형광 현미경으로 배아를 직접 시각화할 수 있어 난자의 신경 이식편 통합 및 혈관 네트워크 발달을 연구할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 조직 이식

1. 유리 마이크로 피펫을 사용하여 해부된 신경관을 시계 유리에서 숙주 배아로 조심스럽게 옮깁니다. 신경관을 올바른 전후방 방향으로 배치하고 마이크로 메스를 사용하여 병아리 숙주의 절제 부위에 인접한 외식편을 부드럽게 밉니다. 신경관의 방향을 식별하기 위해 등쪽 표면에 부착되거나 작은 흠집을 잘라 외배엽의 작은 조각을 남겨 둡니다.
   1. 필요한 경우 마이크로 메스를 사용하여 절제된 영역의 정확한 크기로 외식편을 자릅니다.
2. 신경관을 절제된 부위로 부드럽게 안내하고 등쪽이 올바른 방향이 되도록 배치합니다. 입관에 장착된 유리 마이크로 피펫을 사용하여 이식편 주변의 PBS 및/또는 체액을 제거합니다. 이것은 기증자와 숙주 조직이 부착되고 이식편이 확립되는 데 도움이 됩니다.
3. 탈수 및 오염을 방지하기 위해 24mm 너비의 투명 테이프로 창 전체를 밀봉하십시오.
4. 달걀 껍질에 연필로 표시하여 키메라 배아에 라벨을 붙이고 실험실 책에 번호를 기록합니다. 추가 발달을 위해 계란을 인큐베이터로 되돌립니다.

2. 숙주 배아의 혈관에 DiI 주입

1. 원하는 실험 시점(여기서는 3 - 10일 후)에 인큐베이터에서 키메라 배아를 회수하고 직선 가위를 사용하여 투명 테이프를 제거하여 난자 내의 배아에 접근합니다.
2. 필요한 경우 가위를 사용하여 쉘의 창을 확대하십시오. 융모막이 껍질에 부착된 경우 출혈을 일으키고 혈관 표지를 위태롭게 할 수 있는 융모막이 손상되지 않도록 주의하십시오.
3. 노른자에서 접근 가능한 정맥을 선택하여 혈류가 배아 쪽으로 향하는지 확인하십시오. 방황 정맥 중 하나의 분기점을 선택합니다(그림 1B, C).
   참고: E6.5 - E7.5에서 난황 정맥에 접근하기 위해 핀셋으로 융모막을 옆으로 부드럽게 이동해야 할 수도 있습니다. E8.5 이후에는 이 단계에서 융모막이 배아를 완전히 덮기 때문에 유일한 옵션은 융모막 정맥 중 하나에 주입하는 것입니다.
4. 두 개의 Dumont #5 핀셋을 사용하여 반대 방향으로 찢어 선택한 주입점 위의 vitelline 멤브레인을 제거합니다.
5. CellTracker CM-DiI를 로딩하기 전에 Dumont #5를 사용하여 당긴 유리 바늘을 부러뜨리고 직경을 정맥의 대략적인 크기로 조정합니다. DMSO에서 40μg/μl의 DiI 원액을 만들고 -20°C에 보관합니다. 4μg/μl의 농도로 0.3M 자당/PBS에 작업 용액을 준비합니다.
   1. 입관으로 흡입하여 0.3M 자당/PBS에 5 - 10μl의 DiI를 흡인합니다. 오래된 배아에는 최대 25μl 이상이 필요할 수 있습니다. E8.5부터 배아는 더 크고 근육질의 정맥을 가지고 있으며, DiI가 장착된 유리 바늘로 찌르기 전에 Dumont #5로 제자리에 고정해야 할 수도 있습니다.
6. 바늘을 정맥에 빠르게 삽입하고 입관으로 꾸준히 불어 DiI가 혈전을 형성하지 않고 천천히 혈류에 합류할 수 있도록 합니다. 또는 DiI 전달을 위해 압력 인젝터를 사용하십시오.

결과

그림 1. 정맥 DiI 주사. (A) 권장 기기: a) 파라필름에 CellTracker CM-DiI 드롭, b) 당긴 유리 주입 바늘, c) 입 튜브. (B) E4 키메라 병아리 배아에 대한 정맥 DiI 주사의 개략도. (C) 정맥에 삽입된 DiI를 함유한 미세한 유리 바늘을 나타내는 난자 DiI 정맥 주사에서(화살표). (D) GF...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
병아리 알	Henry Stewart and Co, Louth, UK
수정 GFP 병아리 알 The	Transgenic Chicken Facility, The Roslin Institute, University of Edinburgh
Egg 인큐베이터 (Profi-H Hatcher)	Lyon Technologies, CA, USA	910-033
14C 인큐베이터	정밀 냉각 인큐베이터, Leec Ltd., Nottingham, UK	모델 LT2
실체 현미경	LEICA	모델 MZ 12.5
디지털 카메라	LEICA	DC500
이미지 획득 소프트웨어	LEICA	IM50
거위 목 할로겐 냉광원	Advanced Imaging Concepts, Inc	KL 1500 LCD
입 튜브	SIGMA - ALDRICH	A5177
이송 피펫, 폴리에틸렌	SIGMA - ALDRICH	Z350796
Dumont #5 집게	Fine Science Tools	11251-30
Minutien 핀	Fine Science Tools	26002-15
Dumont AA 집게, Inox 에폭시 코팅	정밀 과학 도구	11210-10
셀로테이프(투명, 24mm 너비)	모든 공급업체
CellTracker CM-DiI	분자 프로브	C-7001
붕규산 유리 모세관, 필라멘트가 없는 얇은 벽	하버드 장치	PY8 30-0035

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