마우스 피질 뉴런에서 축삭 분지의 실시간 체외 이미징

초록

출처: Winkle, CC, et al. 축삭 분지 및 신경 형태 형성 동안 원형질막 전달의 역할을 정의하기 위해 결합된 방법론을 활용합니다. J. Vis. 경험. (2016년)

이 비디오는 피질 뉴런에서 실시간 축삭 분기를 관찰하기 위해 DIC(Differential Interference Contrast) 현미경을 사용하는 라이브 이미징 기술을 보여줍니다. 타임랩스 비디오는 축삭에서 국소적인 엑소사이토시스 및 세포골격 재배열을 유도하는 신호 분자인 netrin-1 처리의 효과를 포착합니다. 이러한 과정은 성숙한 축삭 가지로 발달하는 막 돌출을 시작하여 신경 발달에 대한 통찰력을 제공합니다.

프로토콜

1. 축삭 분기의 미분 간섭 대비(DIC) 타임랩스 현미경 참고

: 이 프로토콜은 DIC를 활용하지만 다른 투과광 현미경 방법을 동일한 목적으로 사용할 수 있습니다(예: 위상차).

1. 시험관 내 (DIV) 2일째, 형질감염되지 않은 뉴런이 들어 있는 유리 바닥 이미징 접시를 예열된 환경 챔버에 넣어 5% CO2 및 37°C의 습한 환경을 유지합니다. 최상의 이미지 품질과 해상도를 위해 60X Plan-Apochromat, 1.4 개구수(NA) DIC 대물 렌즈 및 높은 NA 콘덴서가 장착된 현미경을 활용하십시오.
2. 투과광 조명을 사용하여 안경을 통해 뉴런을 찾도록 초점면을 조정합니다.
3. 이미징 소프트웨어의 다중 영역 획득 기능을 사용하여 최소 6개 셀의 XYZ 위치를 찾아 저장합니다. 최상의 결과를 위해 관심 뉴런이 시야 내에 맞도록 스테이지를 배치합니다.
   1. 250ng/ml netrin-1로 자극하고 '다중 영역 획득 시작'을 누릅니다. 24시간 동안 20초마다 각 위치에서 이미지를 순차적으로 획득하고 필요에 따라 획득을 일시 중지하고 다시 초점을 맞춥니다.
4. Apps>Review Multi Dimensional Data>open 파일 이름을 사용하여 이미징 소프트웨어에서 이미지를 검토합니다. 이미징 세션 중에 형성되는 안정적인 축삭 가지(길이 20μm)를 식별합니다. 선 그리기 도구를 사용하여 축삭 기저부에서 팁까지 안정적인 축삭 분기를 측정하여 20μm 길이 자격을 충족하는지 확인합니다.
   나중에
   1. 가지가 형성되는 영역에서 막 돌출이 시작될 때 netrin 자극 후 프레임 번호와 초기 가지가 길이가 20μm에 도달했을 때 netrin 자극 후 프레임 번호를 스프레드시트에 기록합니다.
   2. 돌출부와 분기 형성 사이의 프레임 수에 20초를 곱하여 분기당 형성 시간을 계산합니다.

재료