마우스 해마에서 미세아교세포 역학의 생체 내 2광자 이미징

초록

출처: Kamei, R., et. al., 마우스 해마에서 미세아교세포의 생체 내 만성 이광자 이미징. J. Vis. 경험. (2022년)

이 비디오는 해마 CA1(Cornu ammonis 1) 및 치상회에서 미세아교세포 역학의 생체 내 2광자 현미경을 위한 설정 및 이미징 프로세스를 보여 최적의 광학 정렬 및 구조적 무결성 평가를 보장합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. CX3CR1-GFP 마우스를 이용한 미세아교세포의 생체 내 만성 2광자 이미징

마

1. 취 유도 후 금속관 내부를 멸균 식염수로 세척하여 이물질을 제거한다. 해마의 흰색 폐포가 유리를 통해 보이는지(그림 1A) 수술 후 출혈과 같은 합병증이 없는지 확인하십시오.
2. 다음 단계에 따라 2광자 현미경 아래에 마우스를 설정합니다.
   2
   1. 광자 현미경의 대물 렌즈 아래 머리 고정 장치와 전동 XY 스캐닝 스테이지에 마우스를 설정합니다. 열 지지를 위해 가열 패드를 사용하십시오. 이 품질 검사는 최대 30분이 소요될 수 있으므로 마취 깊이를 모니터링하고 조정하십시오. 메모: 작동 거리(WD)가 3mm 이상이고 개구수(NA)가 높은 수침 대물렌즈를 사용하는 것이 좋습니다. 대물 렌즈의 보정 칼라는 유리와 생체 재료 사이의 굴절률 불일치를 보상하여 해상도를 향상시킬 수 있습니다.
   2. 유리와 대물 렌즈 사이의 공간을 물로 채우고 기포가 생기지 않도록 각별히 주의하십시오. 필요한 경우 더 많은 물을 담는 플라스틱 필름을 사용하여 금속판의 면적을 확장하여 대물렌즈의 전면 렌즈 전체를 덮습니다.
   3. 뇌에서 발현되는 형광 프로브의 여기를 위해 920nm 파장의 펨토초 펄스 레이저를 켜고 이미지 획득 소프트웨어를 시작합니다.
   4. 전동 스테이지와 전동 초점 시스템을 사용하여 CA1(Cornu Ammonis 1)에 초점을 조정합니다. 펄스 레이저에 의한 연속 조명 하에서 뇌 실질에서 방출되는 형광과 금속 튜브 가장자리에서 반사된 빛의 안내에 따라 표적 구조를 배치합니다.
   5. 전동 초점 시스템으로 초점을 조정하여 유리 바닥에 닿는 뇌 실질의 깊이를 측정합니다. 서로 다른 수평 위치의 깊이를 비교하여 유리 바닥과 이미징 평면의 정렬을 판단합니다.
      1. 유리 바닥이 이미징 평면과 평행하도록 설정될 때까지 헤드 고정 장치를 기울여 마우스 헤드의 각도를 조정합니다.
   6. 대물렌즈의 보정 칼라를 조정하여 CA1의 대상 구조 깊이에서 가장 높은 해상도를 달성합니다.
3. 해마의 2광자 여기로 얻은 이미지의 품질과 강도를 확인하십시오(그림 1B).
   참고: 이미지 저하는 뇌 내부에 조직 손상이 있음을 나타냅니다.
4. 미세아교세포가 이미 분진 형태를 회복했는지 확인합니다(그림 1C).
   참고: 미세아교세포의 이미징 데이터는 미세아교세포가 기저 상태로 돌아가는 데 최소 3-4주가 필요함을 나타냅니다.
5. 실험의 특정 목적을 위해 CA1의 모든 층에서 생체 내 이미징을 수행합니다.

결과

그림 1: 만성기에 있는 CX3CR1-GFP 마우스에서 미세아교세포의 생체 내 이미징. (ᅡ) 만성기에서 우측 등쪽 CA1(Cornu Ammonis 1)에 이식된 창의 대표적인 모습. 유리 바닥을 통해 수술 후 출혈 없이 폐포의 흰색 섬유가 선명하게 관찰됩니다. DHC와 좌심실은 각각 꼬리 내측 영역과 주상외측 가장자리에서 부분...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
쎨토초 펄스 레이저	Spectra-Physics	MaiTai Deep See	A Ti:Sapphire 레이저 920nm 파장에서 사용됩니다.
CA1 이미징을 위한	2광자 현미경	Nikon	A1R MP+
2광자 이미징용 대물 렌즈	Olympus	XLPLN25XSVMP	25× 대물렌즈로 긴 작동 거리, 높은 개구수 및 보정 칼라
플레이트	Narishige	CP-1	고정용 알미늄으로 만들어진
원형 유리 커버슬립	Matsunami Glass	3φ No.1	커버슬립은 스테인리스 스틸 튜브에 접착되어 있습니다.
CX3CR1-GFP 마우스	Jackson Laboratory	8451	미세아교세포 이미징을 위한 형질전환 마우스.
원통형 스테인리스 스틸 튜브	MORISHITA	맞춤형	금속 튜브를 이식합니다. 외경 3.0mm, 내경 2.8mm, 높이 1.7mm.
치과용 레진 시멘트(Super-Bond C&B)	Sun Medical	204610555	치과용 시멘트.
머리 고정 장치	Narishige	MAG-2	각도 조절기가 있는 마우스의 머리 고정 장치,
가열 패드	바이오 연구 센터	BWT-100A 및 HB-10	수술 중 마우스에 열 지원을 제공하는 도구.
가열 패드	ALA Scientific	HEATINGPAD-1 및 Hot-1	도구는 헤드 고정 장치의 마우스에 대한 열 지지를 제공합니다.
케타민(Ketalar)	Daiichi Sankyo Company	S9-001665	수술 중 마취.
안과 연고	Sato Pharmaceutical		수술 중 안구 건조를 예방하는 데 사용됩니다.
포비돈 요오드 스크럽 용액	메이지 세이카 제약	2612701Q1137	수술 부위 소독에 사용됩니다.
실체 현미경	수술용 Leica Microsystems	S8 APO	현미경.
균 식염수	Otsuka Pharmaceutical Factory	3311401A2026	수술 중 세척액.
멸균 방수 패드	AS ONE	8-5945-01	수술 플랫폼.
자일라진(셀락탈 2%)	수술 중 바이엘		마취.

Microscope. 알루미늄 머리 플레이트.멸