마우스 해마에서 미세아교세포 역학의 생체 내 2광자 이미징

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. CX3CR1-GFP 마우스를 이용한 미세아교세포의 생체 내 만성 2광자 이미징

1. 취 유도 후 금속관 내부를 멸균 식염수로 세척하여 이물질을 제거한다. 해마의 흰색 폐포가 유리를 통해 보이는지(그림 1A) 수술 후 출혈과 같은 합병증이 없는지 확인하십시오.
2. 다음 단계에 따라 2광자 현미경 아래에 마우스를 설정합니다.
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   1. 광자 현미경의 대물 렌즈 아래 머리 고정 장치와 전동 XY 스캐닝 스테이지에 마우스를 설정합니다. 열 지지를 위해 가열 패드를 사용하십시오. 이 품질 검사는 최대 30분이 소요될 수 있으므로 마취 깊이를 모니터링하고 조정하십시오. 메모: 작동 거리(WD)가 3mm 이상이고 개구수(NA)가 높은 수침 대물렌즈를 사용하는 것이 좋습니다. 대물 렌즈의 보정 칼라는 유리와 생체 재료 사이의 굴절률 불일치를 보상하여 해상도를 향상시킬 수 있습니다.
   2. 유리와 대물 렌즈 사이의 공간을 물로 채우고 기포가 생기지 않도록 각별히 주의하십시오. 필요한 경우 더 많은 물을 담는 플라스틱 필름을 사용하여 금속판의 면적을 확장하여 대물렌즈의 전면 렌즈 전체를 덮습니다.
   3. 뇌에서 발현되는 형광 프로브의 여기를 위해 920nm 파장의 펨토초 펄스 레이저를 켜고 이미지 획득 소프트웨어를 시작합니다.
   4. 전동 스테이지와 전동 초점 시스템을 사용하여 CA1(Cornu Ammonis 1)에 초점을 조정합니다. 펄스 레이저에 의한 연속 조명 하에서 뇌 실질에서 방출되는 형광과 금속 튜브 가장자리에서 반사된 빛의 안내에 따라 표적 구조를 배치합니다.
   5. 전동 초점 시스템으로 초점을 조정하여 유리 바닥에 닿는 뇌 실질의 깊이를 측정합니다. 서로 다른 수평 위치의 깊이를 비교하여 유리 바닥과 이미징 평면의 정렬을 판단합니다.
      1. 유리 바닥이 이미징 평면과 평행하도록 설정될 때까지 헤드 고정 장치를 기울여 마우스 헤드의 각도를 조정합니다.
   6. 대물렌즈의 보정 칼라를 조정하여 CA1의 대상 구조 깊이에서 가장 높은 해상도를 달성합니다.
3. 해마의 2광자 여기로 얻은 이미지의 품질과 강도를 확인하십시오(그림 1B).
   참고: 이미지 저하는 뇌 내부에 조직 손상이 있음을 나타냅니다.
4. 미세아교세포가 이미 분진 형태를 회복했는지 확인합니다(그림 1C).
   참고: 미세아교세포의 이미징 데이터는 미세아교세포가 기저 상태로 돌아가는 데 최소 3-4주가 필요함을 나타냅니다.
5. 실험의 특정 목적을 위해 CA1의 모든 층에서 생체 내 이미징을 수행합니다.

그림 1: 만성기에 있는 CX3CR1-GFP 마우스에서 미세아교세포의 생체 내 이미징. (ᅡ) 만성기에서 우측 등쪽 CA1(Cornu Ammonis 1)에 이식된 창의 대표적인 모습. 유리 바닥을 통해 수술 후 출혈 없이 폐포의 흰색 섬유가 선명하게 관찰됩니다. DHC와 좌심실은 각각 꼬리 내측 영역과 주상외측 가장자리에서 부분적으로 볼 수 있습니다. 스케일 바, 1mm. (B) POD 24(너비: 511μm, 높이: 511μm, 깊이: 670μm)에서 CX3CR1-GFP 마우스의 생체 내 만성 CA1 이미징에서 대표적인 3D 재구성. (C) 완전히 복원된 분진 형태를 가진 (B)의 미세아교세포의 전형적인 이미지는 수술 표면에서 100, 280 및 500 μm 깊이에서 20 μm 두께의 GFP 이미지 스택의 MIP로 표시됩니다. 스케일 바, 50 μm.