공초점 현미경을 사용한 마우스 신경 말단의 빠른 칼슘 과도 현상 이미징

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 적절한 동물 윤리 검토 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다.

은 장귀거근(m. LAL) 마우스 BALB/C(20-23g, 2-3개월)로부터.

1. 링거 및 파일링 용액의 준비

1. 염화나트륨, NaCl(137mM), 염화칼륨, KCl(5mM), 염화칼슘, CaCl₂(2mM), MgCl₂(1mM), NaH₂PO₄(1mM), NaHCO₃(11.9mM) 및 포도당(11mM). 95% 산소(O₂)와 5% 이산화탄소(CO₂)가 포함된 용액을 통해 기포를 일으키고 필요한 경우 염산/수산화나트륨(HCl/NaOH)을 첨가하여 pH를 7.2-7.4로 조정합니다.
2. 염료 로딩 용액을 준비합니다.
   1. pH가 7.2-7.4 범위인 (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES)(10mM) 용액을 준비합니다. 500μg의 상업용 염료는 500μL 바이알에 들어 있습니다. 염료를 HEPES 용액 14μL에 용해시켜 30mM의 염료 농도를 얻습니다. 잘 흔들어 완전히 녹을 때까지 원심분리합니다.
   2. Ca²⁺ 지시약의 용액을 HEPES 용액으로 1mM 농도로 희석합니다. 냉동실(-20°C)에 보관하고 빛에 노출되지 않도록 하십시오.

2. 염료 로딩 절차

참고: 염료 로딩 절차는 이전에 발표된 프로토콜에서 채택된 신경 그루터기를 통한 로딩 프로토콜에 따라 수행됩니다.

1. 이전에 발표된 프로토콜에 설명된 대로 이 준비에 대한 해부 절차에 따라 LAL 근육을 해부합니다.
   1. 엘라스토머로 코팅된 페트리 접시에 약간 늘어진 조직(초기 길이에서 30% 이하)을 미세한 스테인리스 스틸 핀으로 고정하고 근육이 완전히 덮일 때까지 링거 용액을 추가합니다.
      참고: 페트리 접시는 제조업체의 지침에 따라 엘라스토머로 미리 채워져 있습니다( 재료 표 참조).
2. 충전 피펫을 준비합니다
   1. 마이크로피펫 풀러( 재료 표 참조)를 사용하여 세포내 기록을 위해 가능한 한 날카로운 팁이 있는 마이크로피펫을 준비합니다. 내부 필라멘트가 없는 모세관을 사용하십시오(외경 1.5mm, 내경 0.86 또는 1.10mm).
   2. 연마제로 테이퍼에 점수를 매긴 후 마이크로피펫 팁을 부러뜨리고 팁을 직경 약 100μm까지 열어 둡니다. 내경이 >80μm에서 12-13μm로 줄어들 때 팁을 제한하도록 불 광택을 냅니다. 필링 피펫의 한쪽에 실리콘 튜브를 부착하고 다른 쪽에 주사기(바늘 없음)를 부착합니다.
3. 실체현미경으로 신경줄이 별도의 신경가지로 변하는 곳을 찾으십시오. 왁스를 사용하여 장착된 튜브와 주사기가 있는 충전 피펫을 페트리 접시에 놓습니다. 피펫 팁이 신경 위에 오를 때까지 움직입니다.
4. 가는 가위로 근섬유 가까이에 가까운 신경을 자르고 약 1mm 길이의 신경 그루터기를 남깁니다. 신경 그루터기를 링거 용액과 함께 꼬집지 않고 충전 피펫 끝으로 부드럽게 흡인합니다. 충전 피펫에서 실리콘 튜브를 제거합니다.
5. 긴 필라멘트가 있는 주사기를 사용하여 일정량의 염료 로딩 용액(~0.3μL)을 추출합니다. 이 부피는 필라멘트의 약 3cm에 해당합니다.
   참고: 처음에는 알코올 램프나 가스 버너를 사용하여 불을 당겨 피펫 팁에서 10μL 부피의 필라멘트를 만들어야 합니다.
6. 로딩 용액이 담긴 필라멘트 팁을 충전 피펫에 부드럽게 삽입합니다. 혼합물을 신경 그루터기에 직접 방출합니다. 제제를 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
7. 그 후, 신선한 링거 용액으로 제제를 헹구고 50mL(또는 그 이상) 링거 용액이 있는 유리 비커에서 25°C에서 최대 2시간 동안 배양합니다(제제는 용액으로 덮어야 함). 이 시간 동안 염료는 시냅스에 도달합니다.

3. 공초점 현미경을 사용한 비디오 캡처

참고: 칼슘 과도 현미의 등록은 레이저 주사 공초점 현미경(LSCM)을 사용하여 수행됩니다( 재료 표 참조). 빠른 칼슘 과도 현상을 등록하기 위해 충분한 공간적, 시간적 분해능으로 신호를 기록할 수 있는 독창적인 프로토콜이 사용되었습니다. 현미경에는 20x 수침 대물렌즈(1.00 개구수(NA))가 장착되어 있습니다. 488nm 레이저 라인을 10% 강도로 감쇠시키고 방출 형광을 503nm에서 558nm까지 수집했습니다.

1. 제제를 실리콘 엘라스토머 코팅 실험실에 장착하고 강철 마이크로 바늘 세트로 약간 늘어서 고정합니다. 링거 용액으로 제제를 광범위하게 헹굽니다.
   참고: 챔버 바닥이 엘라스토머로 덮인 유기 유리로 만든 간단한 맞춤형 관류 실험실(제조업체의 지침에 따라 준비, 재료 표 참조)을 사용했습니다. 챔버에는 용액 공급 튜브가 있습니다. 용액은 마그네틱 홀더에 장착된 주사기 바늘을 통해 펌핑됩니다( 재료 표 참조). 실험실로 페트리 접시(제제 배양에 사용되는 것과 같은)를 사용할 수 있지만 공급 및 흡입 튜브가 부착되어 있습니다.
2. 신경을 자극하는 데 사용할 흡입 전극을 설치합니다.
   알림: 욕조 옆에 왁스를 바르고 전극을 놓고 고정합니다. 팁을 신경 그루터기 가까이로 이동하여 전극으로 흡인합니다.
3. 준비 챔버를 현미경 스테이지에 장착하고 입구 및 출구 피팅을 챔버에 배치합니다.
4. 제제를 관류하려면 간단한 중력 흐름 구동 시스템을 사용하십시오. 관류 흡입 펌프를 켜서 여분의 용액을 제거합니다.
5. 자극 흡입 전극을 전기 자극기에 꽂고 자극 후 근육 수축이 발생하는지 확인합니다. 자극 조건 및 기록은 섹션 3.9-3.12를 참조하십시오.
6. d-투보쿠라린(10μM)이 함유된 링거 용액으로 관류 시스템을 채웁니다.
   참고: 이 용액은 근육 수축을 예방하는 데 도움이 됩니다. 시냅스 후막에 있는 니코틴성 아세틸콜린 수용체의 D-투보쿠라린 또는 알파-방가로톡신 특이적 차단제는 근육 수축을 완전히 또는 부분적으로 차단합니다50. 또한, 근육 수축을 예방하기 위해, μ-코노톡신 GIIIB와 같은 시냅스 후 나트륨 채널의 특정 차단제를 사용할 수 있다51.
7. 관류 흡입 펌프를 켜고 d-투보쿠라린이 함유된 링거 용액으로 제제 관류를 시작합니다.
8. LSCM 소프트웨어에서 이미징 매개변수를 다음과 같이 설정합니다.
   1. LSCM 소프트웨어(LAS AF, 재료 표 참조)에서 전기생리학을 선택합니다.
      참고: 이 모드에서는 시점에서 이미지가 캡처되면 트리거 박스를 사용하여 동기화 펄스가 자극기로 전송됩니다. 이것은 준비에서 활동 전위 생성을 유도합니다(그림 1; 자극기 장치).
   2. 획득 모드를 선택합니다. 현미경 동기화 펄스를 사용하여 자극기를 트리거하려면 작업 메뉴 설정에서 트리거 설정을 선택합니다. Trigger Out On Frame 필드를 out1 채널로 설정합니다.
   3. 다음 설정을 사용합니다: 스캔 모드: XYT, 스캔 주파수: 1400Hz, 줌 계수: 6.1, 핀홀: 완전히 열림. 순차 트랜스패스 양방향 X 모드가 켜져 있는지 확인합니다.
   프레임
   4. 을 형성하는 최소 시간을 52ms로 설정하고 원시 비디오에서 프레임을 수집할 프레임을 20프레임으로 설정합니다.
      참고: 이 설정을 사용하면 128 x 128 픽셀의 해상도로 이미지를 캡처하고 52ms마다 단일 프레임을 촬영할 수 있습니다.
   5. 아르곤 레이저의 여기 파장을 출력 전력의 8%로 488nm로 설정합니다.

라이브 모드 버튼을 눌러 라이브 모드로 전환하면 염료가 로드된 신경 말단을 미리 볼 수 있습니다.

9. Stimulation unit
   NOTE: 이 장치를 사용하면 MATLAB 소프트웨어를 통해 자극의 시간적 매개변수를 설정할 수 있습니다.
   1. 새 파일을 만들고 위에서 언급한 기사의 코드를 MatLab 코드 창에 붙여넣고 파일을 저장합니다. 실행을 클릭하면 자극 매개변수가 있는 창이 나타납니다. 자극의 지연 시간과 지속 시간을 설정합니다.
      참고: 지연은 재구성된 형광 신호의 시간적 분해능을 결정합니다. 0.2ms 지속 시간의 전기 펄스가 지연된 다음 절연 장치로 전송됩니다. 후자는 자극 펄스의 진폭과 극성을 형성하고 기록 장비에서 생물학적 물체를 전기적으로 분리합니다.
   2. 신경을 자극하려면 자극 자극의 최대 진폭(모든 신경 섬유를 활성화하는 데 필요한 최대 자극 강도보다 25%-50% 큼)을 선택합니다.
      참고: 제시된 방법은 스윕이 최소화된 LSCM을 사용하여 단일 고속 형광 신호를 기록하기 위한 특수 알고리즘을 기반으로 합니다. 개발된 알고리즘의 각 단계에서 기록된 형광 신호는 현미경 스윕보다 짧은 시간 간격만큼 이전 신호에서 이동합니다. 시간 이동 값은 필요한 신호의 시간적 해상도를 결정합니다. 알고리즘의 단계 수(이동)는 필요한 시간 해상도와 원래 시간 해상도에 따라 다릅니다. 이 등록 방법을 사용하면 제제의 자극이 0.25Hz의 주파수로 수행됩니다.
10. 라이브 모드에서 ROI를 검색하고 최상의 초점을 얻습니다. 데이터 수집 소프트웨어를 실행합니다.
11. 자극기의 지연을 이전 값에 비해 2ms 적게 이동하고 데이터 수집 소프트웨어를 실행합니다.
12. 3.11단계를 26회 반복하여 26개의 시퀀스를 획득하고, 각 시퀀스는 이전 시퀀스에서 2ms 이동합니다.

그림 1: 실험 설정의 개략도. 1. 레이저 주사 공초점 현미경(LSCM). 2. LSCM(트리거 박스)의 동기화 모듈. 3. 자극기. 4. 격리 장치. 5. 생물학적 샘플. 6. 신경의 전기 자극을 위한 흡입 전극. 7. 관류 시스템(7a: 관류액 저장소, 7b: 점적기, 7c: 유량 조절기, 7d: 진공 플라스크). 화살표는 동기화 펄스의 전파 방향을 가리킵니다.