Drosophila Medulla 층과 기둥에 걸친 수지상 형태 분석

초록

출처: Ting, C., et al., 열과 층의 수지상 형태 분석. J. Vis. 경험. (2017년)

이 비디오는 초파리 뇌를 준비하고, 공초점 현미경으로 GFP 표지 수질 수상돌기의 수평 및 정면 이미지 스택을 캡처하고, 층과 열에 걸쳐 형태를 분석하기 위한 3D 재구성을 생성하는 절차를 보여줍니다.

프로토콜

1. 이중 이미지 획득

참고: 이 단계는 두 개의 직교(수평 및 정면) 방향에서 관심 뉴런의 두 이미지 스택을 획득하도록 설계되었습니다.

1. 막 녹색 형광 단백질(GFP) 마커(mCD8GFP)를 사용하여 드물게 표지된 수질 뉴런(~10개 세포/뇌엽)을 포함하는 파리 뇌를 준비합니다. 토끼 항-GFP(수질 뉴런 수상돌기의 경우) 및 마우스 mAb24B10(광수용체 축삭의 경우), 1차 항체 및 형광 2차 항체(Alexa 488 항토끼 및 Alexa 568 항마우스 항체)로 뇌를 염색합니다. 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 70% 글리세롤을 넣어 뇌를 청소합니다.
2. 뇌를 수평 방향으로 장착하려면(그림 1A, B), 글리세롤로 제거된 플라이 뇌를 슬라이드 중앙에 있는 20μL 방울의 퇴색 방지 마운팅 매체로 옮깁니다.
3. 커버슬립이 장착 중에 뇌를 짓밟는 것을 방지하기 위해 커버슬립의 4개 모서리에 작은 점토 패치를 부착합니다.
   참고: 클레이 패치는 커버슬립이 짓밟히는 것을 방지하기 위해 쿠셔닝을 제공합니다.amp르. 각 점토 패치의 직경은 약 1mm여야 합니다.
4. 해부 현미경으로 뇌를 복부 위로 향하게 하고 그 위에 커버슬립을 올려 뇌를 고정합니다. 뇌의 볼록한 등쪽 표면을 랜드마크로 사용하여 뇌 샘플의 방향을 식별합니다(그림 1A).
5. 공초점 현미경으로 첫 번째 이미지 스택(수평 보기)을 얻습니다. 고NA 대물 렌즈(예: 63X 1.3 NA 글리세롤 또는 오일 침지 대물 렌즈) 및 2.5X 디지털 줌(픽셀 크기는 픽셀당 0.105 μm, 평균 수는 2)을 사용하십시오. 180개 이상의 광학 절편(512 x 512 픽셀)을 획득하여 0.2μm의 스텝 크기로 수질 신경 피를 덮습니다.
6. 뇌를 다시 장착하되 뇌를 전방 위로 정렬합니다(정면 보기).
7. 동일한 뉴런의 두 번째 이미지 스택(정면도)을 획득합니다.
   참고: 시엽에 라벨링된 수많은 뉴런이 있는 경우 동일한 뉴런을 찾는 것이 어려울 수 있습니다. 두 방향에서 동일한 뉴런을 식별하려면 두 보기 모두에서 더 낮은 배율의 이미지 스택이 필요할 수 있습니다(예: 저해상도 이미지 스택을 획득하려면 0.7의 확대/축소 및 0.45μm의 스텝 크기 사용). 이미지가 512 x 512보다 큰 경우 이미지 조합 전에 이미지를 512 x 512로 잘라야 하며, 넓은 필드를 이미징하는 동안 픽셀 크기를 픽셀당 0.105μm로 유지해야 합니다. 신호 손실은 심부 조직의 잠재적인 문제입니다. 신호가 약하면 뇌의 복부 절반을 이미지화하십시오. 스캔 중 광표백을 줄이려면 가능한 한 낮은 레이저 출력을 사용하십시오. 이미지 스택을 획득하기 전에 범위 표시기를 사용하여 노출 과다 여부를 확인하십시오. 가능하면 GaAsP 검출기가 장착된 공초점 현미경을 사용하십시오.
8. 수질 신경필(오른쪽/왼쪽[R/L] 및 등쪽/복부[D/V])과 관련하여 관심 있는 뉴런의 위치를 식별하고 기록합니다. 이미지 스택을 검사하여 이미지 획득 중에 샘플이 이동했는지 확인합니다.
   참고: 샘플 이동은 종종 부적절한 장착으로 인해 발생합니다. 샘플 이동이 발생하면 이미지 스택을 등록에 사용할 수 없으며 삭제해야 합니다. 샘플을 다시 마운트하고 동일한 뉴런에서 이미지 스택을 획득합니다.

2. 이미지 디콘볼루션

참고: 디콘볼루션 단계는 이미지 디콘볼루션 소프트웨어를 사용하여 흐림 및 노이즈로 인해 성능이 저하된 획득한 이미지를 복원합니다. 이 단계는 선택 사항이지만 이미지 품질이 크게 향상됩니다.

1. 대화형 모드에서 디콘볼루션 프로그램을 시작합니다. 기본 창에서 메뉴: 파일/열기(또는 Ctrl-o)를 선택하여 이미지 스택(lsm 또는 특정 현미경 형식)을 로드합니다.
2. 로드된 이미지 스택을 클릭하여 선택하고 메뉴: 연산을 선택하여 이미지 작업 창을 엽니다. 기본 클래식 CMLE(Maximum Likelihood Estimation) 알고리즘을 사용합니다.
3. 이미지 조작 창에서 "파라미터" 탭을 클릭합니다. 렌즈 침지 매체(예: 오일, 글리세린 등), 매립 매체(예: 침지 오일 등) 및 개구수(NA; 여기서는 1.3이 사용됨)에 대한 적절한 매개변수를 입력합니다. 나머지 매개변수를 확인하여 이미징 조건을 올바르게 반영하는지 확인합니다. "모두 확인됨 설정" 탭을 클릭하여 매개변수 설정을 완료합니다.
4. 이미지 작업 창에서 "작업" 탭을 클릭합니다. 출력 대상(예: c)을 할당합니다. "채널당 신호/잡음"에 적절한 숫자를 입력합니다(예: "12 12 12 12"가 좋은 시작점이고 기본 설정은 "20 20 20 20"입니다). 나머지 매개변수에 대해 기본 설정을 사용합니다.
5. "명령 실행" 탭을 클릭하여 이미지 스택 디콘볼루트를 시작합니다. 컴퓨터에 따라 이 프로세스를 완료하는 데 최대 수십 분이 걸릴 수 있습니다.
6. 기본 창에서 디컨볼루션된 이미지 스택을 클릭하고 선택합니다. 메뉴: 다른 이름으로 저장을 선택하여 디콘볼루션된 이미지를 ICS 이미지 파일 형식(.ics 및 .ids)으로 저장합니다.
   참고: 각 이미지 스택에는 두 개의 파일이 있습니다. ics 파일에는 헤더 informatio,n이 포함되어 있고 ids 파일에는 원시 이미지 정보가 포함되어 있습니다.
   1. 이미징 방향에 따라 이미지 스택 파일의 이름을 바꿉니다(예: 가로 보기 이미지 스택의 이름을 H.ids 및 H.ics, 정면 보기 이미지 스택의 이름을 F.ids 및 F.ics로 지정).

3. 듀얼 뷰 이미지 조합

참고: 이 단계는 두 개의 이미지 스택을 결합하여 MIPAV 소프트웨어를 사용하여 고해상도 3D 이미지를 생성합니다.

1. 이미지 조합에 대한 행렬 생성.
   1. MIPAV 프로그램을 시작합니다. 메뉴: 디스크에서 파일/이미지 열기(A)(또는 Ctrl-f) /H.ids 및 F.ids; 창에 두 개의 이미지가 표시됩니다.
   2. H 이미지를 클릭하고 메뉴: 유틸리티/변환 도구/RGB/회색을 선택하면 창에 GrayG, GrayB 및 GrayR 이미지가 표시됩니다.
   3. GrayR 및 GrayB를 닫고 GrayG만 창에 유지합니다.
   4. F 이미지를 클릭하고 메뉴: 유틸리티/변환 도구/RGB/회색을 선택합니다. 창에 GrayG1, GrayB1 및 GrayR1 이미지가 표시됩니다.
   5. GrayR1 및 GrayB1을 닫고 창에 GrayG1만 유지합니다. 이 단계에서는 GrayG 및 GrayG1만 창에 있습니다.
   6. GrayG(강조 표시)를 선택하고 메뉴: 알고리즘/등록/최적화된 자동 이미지 등록을 선택하면 "최적화된 자동 이미지 등록 3D" 대화 상자가 나타납니다.
      1. 입력 옵션에서 "자유도"를 기본 "Affine-12"에서 "Specific rescale-9"로 변경합니다. "회전"에서 "회전 각도 샘플링 범위"(기본값: -105도)에서 -30에서 30까지, "거친 각도 증분"에서 10(기본값: 15도), "미세한 각도 증분"에서 3(기본값: 6도)을 입력합니다.
   7. 확인을 클릭합니다. 첫 번째 매트릭스 "GrayG_To_GrayG1.mtx"가 생성되어 이미지 폴더에 저장됩니다. 모든 이미지 창을 닫고 다음 단계로 진행하면 최소 15분이 소요됩니다.
   8. 메뉴: 디스크(또는 Ctrl-f) /H.ids 및 F.ids에서 파일/이미지 열기(A)를 선택하여 H 및 F 이미지 스택을 로드합니다.
   9. 이미지를 클릭하여 H 이미지를 선택하고 메뉴: 유틸리티/변환 도구/RGB/회색을 선택하면 "RGB->회색" 대화 상자가 나타납니다. 확인을 클릭합니다. 창에 "HGray" 이미지가 표시됩니다. HGray를 유지하고 H 이미지를 닫습니다.
   10. F 이미지에 대해 3.1.9단계를 반복합니다. "FGray" 이미지가 창에 나타납니다. FGray를 유지하고 F 이미지를 닫습니다. HGray 및 FGray만 창에 남습니다.
   11. HGray 이미지(하이라이트)를 선택하고 메뉴: 알고리즘/변환 도구/변환으로 이동합니다. "이미지 변환/리샘플링" 대화 상자가 나타납니다. "Resample" 탭을 클릭하고 "HGray"의 크기로 리샘플링을 "FGray"로 변경합니다. 그런 다음 "변환" 탭을 클릭하고 "파일에서 행렬 읽기"를 선택하여 "GrayG_To_GrayG1.mtx"를 로드합니다. 확인을 클릭합니다. 창에 HGray_transform 이미지가 표시됩니다. HGray 이미지를 닫아 HGray_transform와 FGray만 창에 남게 합니다.
   12. "HGray_transform" 이미지(하이라이트)를 선택하고 메뉴: 알고리즘/등록/최적화된 자동 이미지 등록으로 이동합니다. "최적화된 자동 이미지 등록 3D" 대화 상자가 나타납니다. '회전'에서 '회전 각도 샘플링 범위'에서 -5에서 5까지(기본값: -30도), '굵은 각도 증분'에서 3(기본값: 15도), '미세한 각도 증분'에서 1(기본값: 6도)을 입력합니다. 확인을 클릭합니다.
       참고: Affine Matrix(HGray_transform_To_FGray.mtx)가 생성되어 이미지 폴더에 저장되고 "HGray_Transform_register" 이미지가 창에 표시됩니다. 이 단계는 최소 40분이 소요됩니다.
   13. "HGray_transform" 이미지를 닫습니다. 창에는 "HGray_Transform_register" 및 "FGray"만 남아 있어야 합니다.
   14. "HGray_Transform_register" 이미지(하이라이트)를 선택하고 메뉴: 알고리즘/등록/B-스플라인 자동 등록 2D/3D로 이동합니다. "B-스플라인 자동 정합-3D 강도" 대화 상자가 나타납니다. 비용 함수에서 "최소 제곱"을 선택합니다(기본값은 상관 비율).
       1. "2패스 등록 수행"을 클릭합니다. 패스 1 섹션에서 "그라디언트 하강 최소화 단계 크기(샘플 단위)"(기본값은 1)에 2를 입력하고 "최대 반복 횟수:"(기본값은 10)에 10을 입력합니다. 패스 2 섹션에서 "Gradient Descent Minimize Step Size (sample units)"(기본값은 0.5)에 1을 입력하고 "Maximum Number of Iterations:"(기본값은 10)에 2를 입력합니다.
          참고: NLT 행렬 "HGray_transform_register.nlt"가 이미지 폴더에 저장되고 "HGray_transform_register_registered" 이미지가 창에 표시됩니다. 이 단계는 최소 5분이 소요됩니다.
   15. 창의 모든 이미지를 닫습니다.
2. 이미지 조합을 위한 참조 이미지 생성.
   참고: 이 단계는 조합을 위해 등록된 가로 이미지를 생성하기 위한 것입니다.
   1. 메뉴: 디스크(또는 Ctrl-f) /H.ids 및 F.ids에서 파일/이미지 열기(A)를 선택하여 H 및 F 이미지 스택을 로드합니다. 두 개의 이미지가 창에 나타납니다.
   2. H 이미지(강조 표시)를 선택하고 메뉴: 알고리즘/변형 도구/변환으로 이동하면 "이미지 변환/리샘플링" 대화 상자가 나타납니다. "리샘플링" 탭을 클릭하고 리샘플링 크기를 "H"에서 "F"로 변경합니다. 그런 다음 "변환" 탭을 클릭하고 "파일에서 행렬 읽기"를 선택하여 "GrayG_To_GrayG1.mtx"를 로드합니다. 확인을 클릭합니다. H_transform 이미지가 창에 나타납니다. H 이미지를 닫고 창에 H_transform와 F를 유지합니다.
   3. "H_transform" 이미지(강조 표시)를 선택하고 메뉴: 알고리즘/변환 도구/변환으로 이동하면 "이미지 변환/리샘플링" 대화 상자가 나타납니다. "리샘플링" 탭을 클릭하고 리샘플링을 "H_transform"에서 "F" 크기로 변경합니다. 그런 다음 "변환" 탭을 클릭하고 "파일에서 행렬 읽기"를 선택하여 "HGray_transform_To_FGray.mtx"를 로드합니다. 확인을 클릭합니다. "H_transform_transform" 이미지가 창에 나타납니다. H_transform 이미지를 닫습니다. 이 시점에서 창에는 H_transform_transform와 F만 남습니다.
   4. "H_transform_transform" 이미지(강조 표시)를 선택하고 메뉴: 알고리즘/변환 도구/비선형 변환으로 이동하면 "비선형 B-스플라인 변환" 대화 상자가 나타납니다. 그런 다음 "HGray_transform_register.nlt"를 로드하고 확인을 클릭합니다. "H_transform_transform_registered" 이미지가 창에 나타납니다. 이미지를 ics 파일로 저장합니다. 창의 모든 이미지를 닫습니다.
3. 이미지 스택 결합
   참고: 이 단계에서는 직교 방향(수평 및 정면)으로 획득한 두 개의 이미지 스택을 하나의 고해상도 스택으로 결합합니다.
   1. 메뉴로 이동: 플러그인/일반/초파리 망막 등록l; "초파리 망막 등록 v2.9" 대화 상자가 나타납니다. 이미지 H의 "H.ics", 이미지 H-레지스터의 3.2.4단계의 "H_transform_transform_registered", 이미지 F의 "F.ics", 변환 1-녹색(선택 사항)의 3.1.7단계의 "GrayG_To_GrayG1.mtx", 변환 2-Affine의 3.1.12단계의 "HGray_transform_To_FGray.mtx", 변환 3-비선형(선택 사항)의 3.1.14단계의 "HGray_transform_register.nlt"를 업로드합니다.
      1. "H를 F로 크기 조정"에서 SqRt(Intensity-H x Intensity-F)를 선택하고 크기 조정 없음을 선택합니다. 나머지 매개변수에 대한 기본 옵션을 유지합니다. 확인을 클릭합니다. 이 단계는 약 3분
         참고: 처리 후 3개의 이미지 세트가 생성됩니다: combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids(최종 재결합 이미지), greenChannelsImage-Gxreg-Gy-Gcomp.IDS(H, F 및 최종 재결합 이미지에 대한 녹색 채널) 및 redChannelsImage-Rxreg-Ry-Rcomp.ids(H, F 및 최종 재결합 이미지에 대한 빨간색 채널); 모든 출력 파일의 크기는 512 x 512 x 512로 조정됩니다.
   2. 이미지 시각화 소프트웨어에서 "combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids"를 엽니다. 이미지 스택을 ims 형식으로 저장하고 파일 이름을 바꾸십시오. 이 재결합된 이미지 파일은 신경돌기 추적 및 등록에 사용됩니다.

4. 신경돌기 추적 및 기준점 할당

참고: 이 단계에는 신경돌기를 추적하고(4.1) 이미지 시각화 소프트웨어를 사용하여 등록을 위한 기준점을 할당(4.2)하는 작업이 포함됩니다.

1. tracing neurites
   1. 이미지 시각화 소프트웨어를 시작합니다. 재결합된 이미지 파일을 엽니다. 메뉴: 디스플레이 조정 편집/표시로 이동하여 광수용체 채널(빨간색)을 끕니다.
   2. "Surpass" 모드에서 이미지를 시각화합니다. 컴퓨터에 스테레오 그래프 시스템이 장착되어 있는 경우 "스테레오"를 켜고 "쿼드 버퍼" 모드를 사용하여 3D 이미지를 시각화합니다.
   3. 메뉴: Surpass/Filaments로 이동하여 새 필라멘트를 추가합니다. "자동 생성 건너뛰기, 수동 편집" 탭을 클릭합니다.
   4. "그리기" 탭을 클릭하고 "AutoDepth"를 선택합니다.
   "
   5. 설정"을 선택하고 "선"을 선택한 다음 더 나은 시각화를 위해 적절한 픽셀 번호를 입력합니다(이 프로토콜에서는 4픽셀 선이 사용됨). "수지상 표시", "시작점" 및 "분기점"을 선택합니다. "렌더링 품질"을 100%로 설정합니다.
   6. "그리기" 탭을 선택하고 신경돌기 추적을 시작합니다. 축삭으로 시작한 다음 수상돌기로 이동합니다(그림 1D). 경골질 뉴런의 축삭과 수상돌기는 쉽게 구별할 수 있습니다.
      참고: Tm 뉴런은 세포체에서 축삭을 확장하여 더 높은 시각 처리 센터인 소엽까지 투사합니다. 시스템은 자동으로 첫 번째 긴 필라멘트를 축삭으로 정의하고 나머지 짧은 필라멘트를 수상돌기로 정의합니다. 추적하는 동안 필라멘트(축삭)의 시작 부분에 시작점을 유지하고 추적된 신경돌개가 연결되어 있는지 확인하십시오. 분기점과 시작점을 검사합니다. 수상돌기가 연결되지 않은 경우 연결되지 않은 필라멘트에 새 시작점이 정의됩니다.
   7. 추적 후 "설정"으로 돌아가서 "시작점"과 "분기점"을 선택 취소한 다음 메뉴: 선택한 개체 초과/내보내기로 이동합니다. /. 필라멘트를 발명가 파일(*.iv)으로 저장합니다.

결과

그림 1. 듀얼 뷰 이미징을 위한 샘플 준비 및 초파리 수질 컬럼 어레이의 대칭. (A, B) 듀얼 뷰 이미징을 위한 샘플 장착. (A) 마치 커버슬립을 통해 뇌를 보는 것처럼 보입니다. (B) 샘플 장착을 위한 개략도. 수평 스택을 이미징하기 위해 면역 염색된 뇌는 먼저 복부 위쪽 위치에 장착됩니다. 첫 번째 스택을 획득한 후 뇌는 정면 스택을 이미징하기...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Software
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	버전 16.05	이미지 디콘볼루션(https://svi.nl)용. 상용 소프트웨어
MIPAV		버전 7.3.0	이미지 재조합 및 등록용(http://mipav.cit.nih.gov/.). 프리웨어
MIPAV 플러그인: PlugInDrosophilaRetinalRegistration.class			프리웨어
MIPAV 플러그인: PlugInDrosophilaStandardColumnRegistration.class			프리웨어
Imaris	Bitplane		신경돌기를 추적하고 이미지 등록을 위한 기준점을 할당합니다(http://www.bitplane.com). 상용 소프트웨어
Vaa3D			swc 파일 시각화용(https://github.com/Vaa3D/release/releases/). 프리웨어
Matlab	Mathworks	R2014b	돌기의 형태 측정 분석용(http://www.mathworks.com). 상용 소프트웨어
Matlab toolbox: TREES1.14		v1.14	지상 형태 측정 매개변수 분석용( http://www.treestoolbox.org/download.html). 프리웨어
Matlab 도구 상자: Dendritic_Tree_Toolbox		v1.0	측정 매개변수(https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration)를 계산합니다. 프리웨어
샘플 파일
SWC 파일 정의			http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
이미지 조합 및 등록		을 위한 코드 및 샘플 파일	https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
참조점 예시			https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate=1471880596000&api=v2
컴퓨터 시스템
MS Windows Windows 7 x64 또는 Macintosh OS X 10.7 이상			3GHz 64비트 쿼드 코어 프로세서, 16G RAM(최소)
옵션: Quadro4000(또는 그 이상) 그래픽 카드	Nvidia		수상돌기의 입체 시각화용.
선택 사항: NVIDIA 3D vision2	Nvidia		http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
선택 사항: NVIDIA 3D vision2			용 120Hz LCD 디스플레이http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
이미징용 시약
	달 연구 하이브리도마 뱅크	24B10
GFP 태그 항체	Thermofisher Scientific	G10362
염소 항토끼(H+L), Alexa Fluor 488	Thermofisher Scientific	A11034
염소 항마우스(H+L), Alexa Fluor 568	Thermofisher Scientific	A21124
VECTASHIELD 퇴색 방지 마운팅 매체	벡터 실험실	H-1000
마운팅 클레이	피셔	S04179
			경의 70% 글리세롤
고성능, D=0.17mm	Zeiss	474030-9000-000

수상 수 형태 : 24B10 항체 발 1X PBS 커버 안,