세포 기반 신경 전달 물질 형광 조작 리포터를 사용한 이미징 신경 전달 물질 방출

초록

출처: Lacin, E., et al. 생체 내 신경 전달 물질의 광학 검출을 위한 세포 기반 신경 전달 물질 형광 공학 리포터(CNiFER)의 구성. J. Vis. 경험. (2016년)

이 비디오는 마우스 피질에 사전 주입된 특수 리포터 세포인 세포 기반 신경 전달 물질 형광 공학 리포터(CNiFER)를 사용하여 생체 내 신경 전달 물질 방출을 이미징하는 기술을 보여줍니다. 2광자 현미경 아래에 위치한 마우스는 형광 방출을 통해 신경 전달 물질 유도 칼슘 신호를 시각화할 수 있습니다. 이 방법은 CNiFER의 G-단백질 결합 수용체에 대한 신경 전달 물질 결합을 활용하여 칼슘 방출 및 형광을 유발하여 신경 전달 물질 활성을 실시간으로 감지합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 마우스 피질에 CNiFER 이식

1. 수술 전에 모든 수술 도구를 오토클레이브에서 멸균합니다. 70% 에탄올로 닦고 깨끗한 실험실 기저귀를 깔아 수술을 위한 반멸균 영역을 준비합니다.
2. 수직 전극 풀러에서 유리 모세관(내경 0.53mm)을 당겨 CNiFER 주입 피펫을 준비합니다. 한 쌍의 5번 가는 끝 겸자를 사용하여 전극의 끝을 ~40μm의 직경으로 부수십시오.
   참고: 이것은 눈금선이 있는 실체 줌 현미경에서 가장 잘 수행됩니다.
3. 성인(출생 후 60-90일) C57BL/6 마우스를 이소플루란으로 마취: 유도를 위해 4%(v/v) 및 유지를 위해 1.5 내지 2.0%(v/v)를 마취합니다. 꼬리 또는 발가락을 꼬집어 마우스가 완전히 마취되었는지 확인합니다.
   참고: 주기적으로 다시 꼬집고 수술 내내 수염 경련을 평가하여 마취 깊이를 재평가합니다.
4. 건조를 방지하기 위해 안과용 연고로 눈을 덮으십시오. 이어바가 있는 정위 프레임에 마우스를 장착합니다. 직장 프로브에 의해 조절되는 열 패드를 사용하여 마우스 체온을 37°C로 유지합니다.
....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시아노아크릴레이트 접착제	록타이트	록타이트 495호	수술 및 정위 주입
플라스틱 파라핀 필름	VWR	파라필름®수술	및 정위 주입
NANOINJECTOR	Drummond	3-000-204	수술 및 정위 주입
유리 전극	Drummond	3-000-203G	수술 및 정위 주입
휴대용 드릴	OSADA	Exl-M40	수술 및 정위 주입
드릴용 버	Fine Scientific	19007-05; 19007-07)	수술 및 정위 주사
살균 수조	FST	18000-45, 핫 비드 멸균기	수술 및 정위 주사
이소플루란 챔버/마스크	하이랜드 의료 장비	564-0427, HME 109 이소플루란 기화기가 있는 탁상용 마취 기계, O2 유량계, 갱 밸브; 564-0852, 유도 챔버 16X7X7.5cm	수술 및 정위 주
이		수술 및 정위 주입
		이 있는 3D 범위	수술 및 정위 주사
타딘			수술 및 정위 주사
70%(v/v) 이소프로필 알코올			수술 및 정위 주사
비돈-요오드 준비 패드	dynarex	1108	수술 및 정위 주사
NaCl 0.9%(주사, USP, 918610)			수술 및 정위 주사
CYCLOSPORINE (INJECTION, USP)			수술 및 정위 주사
Buprenex (INJECTION) 부프레노르핀 (설치류 g 당 0.03 μg)	Sigma		수술 및 정위 주사
과 연고	Akorn	NDC 17478-235-35	수술 및 정위 주사
Surgifoam	Ethicon		수술 및 정위 주사
그립 치과용 시멘트	Dentsply	#675571, 675572	수술 및 정위 주입
Instant SuperGlue	NDindustrial		수술 및 정위 주입
LOCTITE 4041			수술 및 정위 주입
METABOND	C&B		수술 및 정위 주입
번호 0 커버 유리	피셔		수술 및 정위 주입 정
	Kopf		수술 및 정위 주사
프로브 및 가열 패드	FHC	40-90-8D, DC 온도 컨트롤러, 40-90-2-06, 6.5X9.5cm 가열 패드 40-90-5D-02, 직장 서미스터 프로브	수술 및 정위 주
광학 이미징용 브레드보드	Thorlabs		수술 및 정위 주입
네랄 오일	Fisher	S55667	수술 및 정위 주입
Kwik-Cast(실리콘 엘라스토머)	World Precision Instruments		수술 및 정위 주입
합사	Ethicon	18'', 1667, 4-0	수술 및 정위 주입
가위	Fine Scientific Tools	91500-09, 15018-10	수술 및 정위 주사
Forcepts	Fine Scientific Tools	11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10	수술 및 정위 주사
학생 Halsted-Mosquito 지혈제	Fine Scientific Tools	91308-12	수술 및 정위 주사
Small Vessel 소작기 키트	Fine Scientific Tools	18000-00	수술 및 정위 주사
Hot Bead Sterilizers	Fine Scientific Tools	18000-45	수술 및 정위 주사
실리콘 매트가 있는 기기 케이스	Fine Scientific Tools	20311-21	수술 및 정위 주입
실리콘 매트가 있는 플라스틱 멸균 용기	Fine Scientific Tools	20810-01	수술 및 정위 주입
체 내 이미징용 2P 고정 단계 형광 스코프	Olympus	FV1200 MPE	생체 내 이미징
광자 레이저	SpectraPhysics	Mai Tai DeepSee	생체 내 이미징
그린 레이저	올림푸스	473 nm 레이저	생체 내 이미징
xy 번역 베이스	Scientifica	MMBP	생체 내 이미징
YFP 및 CFP용 FRET 필터 큐브	림푸스		생체 내 이미징
25-X 물 침수 대물렌즈	올림푸스		생체 내 이미징
에어 테이블	뉴포트		생체 내 이미징
맞춤형 차광 케이지	Thorlab		생체 내 이미징

입 팔 자 스 광섬유 조명 베 포 안위 프레임 직장 입 미 봉 생 다 올