세포 기반 신경 전달 물질 형광 조작 리포터를 사용한 이미징 신경 전달 물질 방출

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 마우스 피질에 CNiFER 이식

1. 수술 전에 모든 수술 도구를 오토클레이브에서 멸균합니다. 70% 에탄올로 닦고 깨끗한 실험실 기저귀를 깔아 수술을 위한 반멸균 영역을 준비합니다.
2. 수직 전극 풀러에서 유리 모세관(내경 0.53mm)을 당겨 CNiFER 주입 피펫을 준비합니다. 한 쌍의 5번 가는 끝 겸자를 사용하여 전극의 끝을 ~40μm의 직경으로 부수십시오.
   참고: 이것은 눈금선이 있는 실체 줌 현미경에서 가장 잘 수행됩니다.
3. 성인(출생 후 60-90일) C57BL/6 마우스를 이소플루란으로 마취: 유도를 위해 4%(v/v) 및 유지를 위해 1.5 내지 2.0%(v/v)를 마취합니다. 꼬리 또는 발가락을 꼬집어 마우스가 완전히 마취되었는지 확인합니다.
   참고: 주기적으로 다시 꼬집고 수술 내내 수염 경련을 평가하여 마취 깊이를 재평가합니다.
4. 건조를 방지하기 위해 안과용 연고로 눈을 덮으십시오. 이어바가 있는 정위 프레임에 마우스를 장착합니다. 직장 프로브에 의해 조절되는 열 패드를 사용하여 마우스 체온을 37°C로 유지합니다.
5. 동물용 전기 면도기로 약 5mm x 12mm의 면도를 합니다. 베타딘을 바르고 70%(v/v) 이소프로판올을 바릅니다. 메스 칼날을 사용하여 두개골 표면의 피부를 자르고 제거합니다. 메스 칼날을 사용하여 두개골 표면에서 골막을 제거합니다. 정위 수술에 대해 설명한 대로 두개골 표면을 노출하고 청소합니다.
6. 빈 유리 피펫을 bregma로 내리고 전후방(A/P) 및 중외측(M/L) 좌표를 기록합니다. 마우스 뇌 아틀라스를 참조하여 주사 부위의 위치를 계산합니다. 피펫을 표적 부위로 옮기고 후속 창 형성을 위해 두개골을 표시합니다.
   참고: 주사 부위와 창은 연구할 영역과 피질에서 신경 전달 물질 또는 펩타이드 방출 돌기의 분포에 따라 다릅니다. 예를 들어, 최근 간행물에서 정위 좌표 +1.0 내지 +2.0 mm A/P 및 +1.0 내지 +2.0 mm M/L을 사용하여 CNiFER 세포를 전두엽 피질에 주입하여 고전적 컨디셔닝 동안 도파민 방출의 생체 내 이미징
을 수행했습니다.
7. 2mm x 3mm 얇아진 두개골 창을 형성합니다.
   참고: 창의 뼈는 두께가 15-20μm여야 합니다. 뼈가 충분히 얇아지면 두개골 표면이 축축해졌을 때 뼈의 작은 흰색 반점이 보이지 않아야 합니다.
8. 인공 뇌척수액(ACSF)에 적신 스펀지를 창에 올려 주입할 세포를 준비하는 동안 촉촉함을 유지합니다.
9. T75 플라스크에서 성장한 CNiFER 클론을 ~80% 합류로 수확합니다. 배지를 흡인하고 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척합니다. 참고: 이 단계에서는 트립신을 생략합니다.
10. PBS를 제거하고 10ml의 ACSF를 사용하여 플라스크 바닥에서 세포를 제거합니다. 세포 덩어리를 해리하기 위해 세포를 분쇄합니다. 펠릿을 원심분리하고 100μl의 ACSF에 재현탁합니다. 1,400 x g에서 30초 동안 원심분리하고 상청액을 제거하고 ACSF로 덮인 펠릿을 남깁니다. 이 단계는 현탁액에 세포 덩어리를 남깁니다.
11. 1.2단계에서 준비한 주입 피펫에 미네랄 오일을 다시 채우고 피펫을 나노인젝터에 로드한 다음 플런저를 전진시켜 작은 오일 비드를 배출합니다. 5μl의 CNiFER 세포 현탁액을 마우스 준비 근처의 플라스틱 파라핀 필름 스트립에 놓습니다. CNiFER을 끌어올리거나 CNiFER 세포를 당긴 피펫에 넣습니다.
12. 피펫을 대상 X 및 Y 좌표, 즉 1.5단계에서 기록한 A/P 및 M/L로 이동합니다. 피펫을 내려 얇아진 두개골을 뚫고 두개골 표면 아래 ~200-400μm까지 계속 내려 피질의 2/3층에 CNiFER 세포를 침착시킵니다.
13. 나노인젝터를 사용하여 가장 깊은 부위에 ~4.6nl의 CNiFER 세포를 주입하고 오일과 세포 계면의 움직임을 기록한 다음 세포가 분배될 때까지 5분 동안 기다립니다. 피펫을 ~100μm로 빼내고 CNiFER 세포를 추가로 ~4.6nl로 주입하고 5분 동안 기다립니다. 그런 다음 CNiFER의 역류를 방지하기 위해 피펫을 천천히 부드럽게 빼냅니다. 하나 이상의 인접 부위에 주사를 반복합니다.
14. 대조군 HEK293 세포(즉, G 단백질 결합 수용체[GPCR]가 결여된 HEK293/TN-XXL/Gqi5 클론)로 주입 단계 1.8-1.12를 반복합니다. CNiFER을 분리하고 세포 주입 부위를 ~200μm로 분리합니다.
15. 세포 이식을 완료한 후 얇아진 두개골 창을 ACSF로 헹구고 두개골이 마를 때까지 기다립니다. 창 위에 시아노아크릴레이트 접착제 한 방울(재료 참조)을 바르고 접착제 위에 미리 절단된 멸균 커버 유리를 빠르게 놓습니다. 덮개 유리를 두개골에 대고 몇 초 동안 부드럽게 밀어 넣습니다. 접착제를 2분 동안 건조시킵니다.
16. 커버 유리의 가장자리를 치과용 시멘트로 밀봉하고 창 주위에 우물을 만들어 담그는 대물렌즈를 위한 물을 담습니다.
17. 이미징 중에 마우스의 머리를 고정하려면 창 뒤에 시아노아크릴레이트 접착제를 소량 떨어뜨린 맞춤형 헤드 바를 부착하십시오. 접착제를 완전히 건조시킨 다음 치과용 시멘트를 추가하여 맞춤형 헤드 바를 더욱 강화합니다.
18. 창을 제외한 두개골 표면의 나머지 부분을 치과용 시멘트 층으로 덮습니다. 피부 가장자리가 시멘트로 덮여 있는지 확인하고 20분 동안 건조시킵니다.
19. 수술 후 이소플루란 투여를 중단하고 마취에서 완전히 회복될 때까지 케이지의 가열 패드 위에 마우스를 두십시오. 재수화를 위해 식염수(피하[s.c.])에 5%(w/v) 포도당을 주입하고 수술 후 진통을 위해 0.05 내지 0.1mg/kg 부프레노르핀(복강내[i.p.], 즉시 방출)을 주입합니다.
    참고: 인간 CNiFER에 대한 잠재적인 면역학적 반응을 최소화하기 위해, CNiFER을 주입하기 전날부터 매일 마우스에 20μl/100g 사이클로스포린(i.p.)을 주입하십시오.
20. 음식과 물을 얻기 위해 마우스를 집 케이지로 되돌립니다.

2. CNiFER 클론의 생체 내 이미징

참고: 라이브 이미징은 2광자 현미경과 머리 고정 장치를 사용하여 마우스를 대상으로 수행됩니다. 이미징 세션 중에는 마취가 필요하지 않습니다. 깨어 있는 상태의 동물을 영상화할 때 스트레스 수준을 줄이기 위해 머리 받침대를 한 번에 몇 시간으로 제한하십시오. 동물을 집으로 돌려보내십시오 사료와 물을 위한 이미징 세션 사이에 케이지. 실내 조명과 인클로저 내 마우스 주변 부분을 어둡게 하여 잠재적인 스트레스를 최소화합니다.

1. 수술 다음날 두개골에 이식된 금속 헤드 바를 머리 고정 프레임에 나사로 고정하여 이미징 플랫폼에 마우스를 장착합니다.
   참고: 깨어 있는 마우스를 이미징할 때 머리 받침대 장치에 의해 유발되는 잠재적인 스트레스로 인해 이미징 세션은 몇 시간을 초과해서는 안 됩니다.
2. 머리 고정 마우스가 있는 이미징 플랫폼을 10X(0.30 NA) 및 40X(0.80 NA) 수침 대물렌즈가 장착된 2광자 이미징 현미경에 놓습니다.
3. 형광 공명 에너지 전달(FRET) 이미징용 필터 큐브(eCFP[Enhanced Cyan Fluorescent Protein] 및 Citrine)는 505nm의 이색성 거울과 eCFP 측정을 위한 460nm에서 500nm, 황수정 측정을 위한 520nm에서 560nm에 이르는 대역 통과 필터가 있습니다.
4. 얇아진 두개골 창이 있는 우물에 ACSF를 추가하고 침수 대물렌즈를 ACSF로 내립니다. 접안렌즈를 수은 램프 및 녹색 형광 단백질(GFP) 필터 큐브와 함께 사용하여 창 아래의 피질 및 맥관 구조의 표면을 찾습니다.
   참고: 맥관 구조의 패턴은 반복되는 이미징 기간 동안 동일한 영역을 찾고 이미지화하는 데 도움이 됩니다. GFP 필터 큐브와 수은 램프를 사용하여 세포 위의 피질 표면에 수동으로 초점을 맞춰 CNiFER을 찾으려면 40X 수침 대물렌즈로 전환합니다.
5. 2광자 이미징을 위해 설정합니다. 2광자 이미징에 적합한 광 경로를 선택합니다. 일반적인 상용 시스템의 경우 소프트웨어를 사용하여 2광자 이미징 모드로 전환하고 디스캔되지 않은 검출기의 광전자 증배관(PMT)으로 빛을 리디렉션합니다. 근적외선 펨토초 펄스 레이저를 켜고 820nm의 파장과 5-15%의 출력 설정을 선택합니다.
   참고: 5% 전력은 일반적으로 시편에서 ~25mW를 제공합니다.
6. PMT1 및 PMT2 전압을 PMT에 따라 일반적으로 700-1,000V의 최대값에 가깝게 설정합니다. 각 채널에 대해 게인을 1로 설정하고 대물렌즈의 z 위치를 0
으로 설정합니다.
7. 대물렌즈를 피질 표면에서 ~100-200μm 낮추고 x-y 스캔을 시작합니다. 각 채널(예: eCFP 및 Citrine)에 대한 레이저 출력, 이득 및 PMT 전압을 조정하여 CNiFER 형광의 신호 대 잡음비를 최적화합니다.
8. 소프트웨어의 확대/축소 기능을 사용하여 이미지를 CNiFER 셀과 배경 영역이 포함된 영역으로 제한합니다. 픽셀당 4μs에서 2초(0.5Hz)마다 한 프레임보다 느리지 않은 스캔 속도를 사용합니다. 적절한 신호 대 잡음비(예: Kalman 2라인 평균화)를 위해 라인 평균화를 조정합니다.
9. 평면당 약 3-4개의 셀을 둘러싸고 CNiFER 셀 주위에 관심 영역(ROI)을 그립니다. ROI 평균 강도에 대한 실시간 분석을 설정합니다. 시간 경과에 따른 CNiFER 형광을 모니터링하기 위해 획득을 시작합니다.
10. 사용자가 결정한 대로 전기 자극, 채널로돕신-2(ChR2) 자극, 행동과 같은 실험 조작 전과 도중에 CNiFER에서 형광을 수집합니다.
11. 이미징 실험이 완료되면 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다. 원하는 대로 며칠에 걸쳐 이미징을 반복합니다. 세포를 다시 이미징할 때 이전에 획득한 저배율 맥관 구조 이미지를 참조하여 동일한 이미징 필드로 다시 방향을 지정합니다(단계 2.4).
    참고: 이식된 CNiFER은 최소 7일 동안 이미징할 수 있습니다.