Caenorhabditis elegans의 뉴런에서 세포내 칼슘 역학 이미징

초록

출처: Doser, R., et al. 생체 내 신경 칼슘 처리의 세포 내 이미징. J. Vis. 경험. (2023년)

이 비디오는 형질전환 Caenorhabditis elegans 균주의 복부 신경 코드 뉴런에서 세포내 칼슘 플럭스의 생체 내 이미징을 보여줍니다. 두 가지 별개의 칼슘 지표가 사용됩니다: 한 균주의 세포질 지표와 다른 균주의 미토콘드리아 지표. 뉴런은 자발적인 뉴런 활동 중 칼슘 플럭스를 반영하여 뉴런 세포질 및 미토콘드리아 내 형광 강도의 실시간 변화를 모니터링하기 위해 형광 현미경으로 관찰됩니다.

프로토콜

1. 이미징을 위한 벌레 준비

1. 한천 패드 준비
   1. 분자 등급 한천을 M9에 녹여 13mm x 100mm 유리 배양 튜브에 몇 초 동안 전자레인지에 돌려 10% 한천 3mL를 만듭니다.
      참고. 용융된 한천은 최대 1시간 동안 열 블록에 보관하거나 한천 패드가 필요할 때마다 신선하게 만들 수 있습니다.
   2. 각각 두 겹의 실험실 테이프가 있는 두 개의 추가 슬라이드 사이에 현미경 슬라이드를 놓습니다(그림 1A-i 참조).
   3. 1,000μL 피펫 팁(필터 제외)의 끝을 자르고 이를 사용하여 중앙 커버슬립에 작은 한천 방울을 피펫팅합니다(그림 1A-i).
   4. 한천 위에 있는 다른 슬라이드를 아래로 눌러 한천을 평평하게 만듭니다(그림 1A-ii).
   5. 냉각 후, 13mm x 100mm 유리 배양 튜브(그림 1A-iii)의 개구부를 사용하여 한천을 작은 디스크로 자른 다음 주변 한천을 제거합니다.
2. 웜 롤링 용액 준비
   1. M9에 무시몰 분말을 녹여 30mM 스톡을 만듭니다. 50μL 분취량으로 분리하고 4°C에서 보관합니다.
   2. 3-5일마다 30mM muscimol의 새로운 분취량을 해동합니다(사용 중 20°C에서 보관).
   3. 30mM 무시몰 스톡을 폴리스티렌 비드로 1:1 비율로 희석하여 롤링 용액을 만듭니다.
3. 이미징을 위한 웜 위치 지정
   1. 1.6 μL의 롤링 용액을 한천 패드 중앙에 놓습니다.
      참고: 더 어리은(적은) 또는 나이가 많은 동물(많은)을 이미징하기 위해 액체의 양을 조정해야 합니다.
   2. 선호하는 웜 픽(즉, 유리 또는 백금 와이어 픽)을 사용하여 다중 외음부 표현형이 없는 원하는 연령의 웜을 한천 패드의 롤링 용액으로 옮깁니다(그림 1A-iv). 메모. 대표적인 데이터는 생후 1일된 자웅동체(GCaMP6f 균주 = FJH185; mitoGCaMP 균주; FJH597), 계란이 한 줄만 있는 것으로 식별할 수 있습니다.
   3. muscimol이 웜의 움직임을 감소시킬 때까지 ~5분 동안 기다린 다음 한천 패드 위에 22mm x 22mm 커버슬립을 떨어뜨려 웜의 움직임을 물리적으로 제한합니다.
   4. 복부 신경줄의 신경돌기를 이미징하려면 커버슬립을 가볍게 밀어 그림 1B 및 1C에 표시된 방향으로 웜을 굴립니다.
      NOTE. 복부 신경줄을 시각화하려면 머리가 위로 향하도록 벌레를 배치하고 장이 근위 부분의 오른쪽과 벌레의 원위 부분의 왼쪽에 올 때까지 벌레를 굴립니다(보는 사람의 관점에서). 등쪽 신경줄의 신경돌기를 이미징하기 위해 이 방향(그림 1C)을 뒤집습니다.
4. 현미경에 웜 장착
   1. 현미경 스테이지에 장착하기 전에 커버슬립에 침지 오일 한 방울을 놓습니다.
   2. 명시야에서 저배율 대물렌즈(10x) 대물렌즈를 사용하여 웜을 찾습니다.
   3. 100배 대물렌즈로 전환하고 초점을 조정합니다.
   4. 488nm 이미징 레이저로 GCaMP 또는 mitoGCaMP의 조명을 사용하여 AVA 신경돌기를 찾습니다.
      참고: 웜이 찌그러지거나 커버슬립이 당겨지지 않도록 약간의 조정을 사용하십시오.

2. 고해상도 이미지 스트림 획득 생

1. 체 내 GCaMP 이미징
   1. 노출 시간을 20ms로 설정합니다.
   2. 기본 GCaMP 형광이 카메라 다이내믹 레인지의 중간 범위에 도달할 때까지 이미징 레이저 및 획득 설정을 조정합니다. 다른 현미경 설정을 사용하여 이미징 매개변수를 최적화하는 방법에 대한 제안은 토론을 참조하십시오.
      참고: 이 연구에 사용된 광학 설정의 경우 488nm 이미징 레이저를 레이저 출력 = 50% 및 감쇠 = 1의 출력 설정으로 설정합니다. 추가 획득 설정을 다음과 같이 수정합니다: EM 전자 증식) 이득 = 200 및 프리앰프 이득 = 1.
   3. 100배 배율의 GCaMP 형광을 사용하여 AVA 신경돌기를 찾은 후 Z-드리프트 보정기(ZDC, 재료 표 참조)를 ±30μm 범위로 설정하고 연속 자동 초점을 시작합니다. 이미징하기 전에 필요에 따라 초점면을 수동으로 수정하십시오.
   4. 100배 배율로 이미지 스트림을 획득합니다. 이 연구에 사용된 설정으로 10분의 지속 시간을 달성할 수 있습니다.
2. 생체 내 mitoGCaMP 이미징
   1. 필요에 따라 2.1.1-2.1.2단계를 따라 카메라의 다이내믹 레인지에 대한 중간 범위에서 기초 mitoGCaMP 형광을 획득합니다.
      참고. 이 연구에 사용된 광학 설정의 경우 488nm 이미징 레이저를 레이저 출력 = 20% 및 감쇠 = 10의 출력 설정으로 설정합니다. 수집 설정을 EM 게인 = 100 및 프리앰프 게인 = 2로 수정합니다.
   2. 미토GCaMP 형광을 사용하여 AVA 신경돌기의 미토콘드리아를 찾은 후 위의 2.3단계에서 설명한 대로 ZDC를 설정합니다.
   3. 100배 배율로 이미지 스트림을 획득합니다.

결과

그림 1: 복부 신경줄을 이미징하기 위한 C. elegans 장착 및 롤링.(A) 한천 패드를 준비하고 단일 웜을 롤링 용액으로 선택하는 단계의 그림. (B) 이미징을 위해 재배치되기 전의 웜 위치의 예. 빨간색 화살표는 커버슬립을 오른쪽으로 밀어 얻을 수 있는 웜의 오른쪽 롤이 필요함을 나타냅...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100x/1.40 오일 대물렌즈	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 대물렌즈	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm 커버 유리	VWR	48366-227
아가로스 SFR	VWR	J234-100G
CleanBench 실험실 테이블	제어 기능이 있는	TMC
필터 휠 또는 슬라이더	ASI		직경 25mm 필터용
FJH 185	Caenorhabditis 유전학 센터	FJH 185	벌레 균주
FJH 597	Caenorhabditis 유전학 센터	FJH 597	벌레 균주
GFP 대역 통과 방출 필터	Chroma		525 ± 50 nm (직경 25 mm)
ILE 레이저 결합기	Andor Technologies		4 레이저 라인
ILE 솔리드 스테이트 488 nm 레이저	Andor Technologies		50 mW
IX83 회전 디스크 공초점 현미경	Olympus		Yokogawa CSU-X1 회전 디스크
iXon Ultra EMCCD 카메라	Andor Technologies
저자동 형광 침지 오일	Olympus	Z-81226
MetaMorph	분자 장치		버전 7.10.1
현미경 컨트롤 박스	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
폴리비드 마이크로스피어	폴리사이언스 주식회사	00876-15	0.094 μm
안정성 챔버	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	15 °C로 설정
대 컨트롤러	ASI		필터 휠 제어 포함
표준 현미경 슬라이드	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
터치 패널 컨트롤러	Olympus		I3-TPC
Z-드리프트 교정기	올림푸스		IX3-ZDC2

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