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1. 신경 배양
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- 웰 배양 플레이트를 유리 커버슬립으로 폴리오르니틴(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline(DPBS)에서 1/6으로 희석, 스톡 농도 0.01%)으로 밤새 처리한 다음 DPBS에서 3회 세척합니다. 그런 다음 플로우 후드 아래에서 최소 10시간 동안 라미닌(원고 농도 1mg/ml, DPBS에서 500배 희석)을 첨가합니다.
- Dulbecco의 변형된 독수리 배지/영양 혼합물 F-12 또는 DMEM/F12(500ml), N2 보충제 2개 바이알(각 5ml), B27 보충제 2개 바이알(각 10ml), B27 보충제 2개 바이알(각 10ml), 펜-스트렙토마이신 10ml(페니실린 = 10,000 단위/ml 및 스트렙토마이신 = 10,000 단위/ml), 2-메르캅토에탄올 1ml(원액: 50mM) 및 라미닌(1/500), 성장 인자 없음.
중요한 단계: 세포 클러스터링을 줄이기 위해 느리게 회전하는 움직임으로 세포를 추가하여 이 단계를 신중하게 수행합니다. - 배양 배지를 제거합니다. 2μg/ml의 신선한 라미닌 용액을 함유한 신선한 N2B27 배지를 첨가하여 뉴런을 유리 커버슬립에 부착된 상태로 유지하고 뭉치는 것을 방지합니다. 3일마다 배지를 교체하십시오. 세포가 건조되는 것을 방지하기 위해 신선한 배지를 추가하기 전에 남은 배지(200μl)의 일부를 유지하십시오. 또는 빠르게 진행하여 총 부피(3ml)를 변경하십시오.
2. 렌티바이러스 형질도입
참고: 녹색 형광 단백질(GFP) 발현은 마우스 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터에 의해 구동됩니다. 이 연구에서 바이러스 역가는 400ng/μl(인산염 완충 식염수(PBS) 1x의 원액)였습니다.
- 배양 웰(6웰 플레이트)당 40ng의 GFP 렌티바이러스 벡터를 함유하는 1μl의 스톡 용액을 첨가하여 바이러스 입자에 의한 성숙의 모든 단계에서 인간 유도 만능 줄기 세포 또는 iPSC 유래 뉴런을 형질도입하고 신선한 배양 배지에서 48시간 동안 배양합니다. 참고: 이 프로토콜의 경우 배양 기간은 척추 구조의 좋은 라벨링을 허용합니다.
3. 면역형광
참고: 전체 척추 형태의 표지를 개선하기 위해 투과화 조건에서 항-GFP 항체를 사용하여 면역형광 표지를 수행했습니다.
- 배양 배지를 제거하고 형질도입된 세포를 4% 파라포름알데히드에 커버슬립에 실온 또는 RT에서 10분 동안 고정한 다음 1x PBS에서 3회 세척합니다(각각 10분
).- 0.05% Triton(100x) 및 10% 말 혈청이 보충된 PBS에 커버슬립을 RT에서 1시간 동안 담근 다음 1x PBS에 3회 세척합니다.
- GFP에 대해 상승되고 각 커버슬립에 1,000배로 희석된 4% 말 혈청 및 1차 항체(1/1,000)가 보충된 1x PBS 100μl를 추가합니다. 4°C의 다크 박스 O/N에서 배양한 다음 1x PBS로 3회 세척합니다.
- Alexa Fluor 488 접합 항체(1/200)를 0.5% Tween 20으로 보충된 PBS에 희석하고 RT에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 1x PBS로 3회 세척하고 형광 현미경용 마운팅 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 커버슬립을 장착합니다.
4. 수지상 척추 이미징
- : 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 통해 공초점 이미징을 수행합니다.
- 피라미드 형태와 완전한 수지상 수목화를 가진 건강한 뉴런을 선택하고 별도의 실험에서 조건당 최소 10개의 뉴런을 정량화합니다. 수상돌기당 60 - 100μm를 정량화합니다.
- 40X 오일 NA = 1.3 대물렌즈와 GFP 여기를 위한 488nm 레이저 라인을 사용하여 이미지를 획득하며, 샘플 수준에서 일반적인 피크 전력은 약 20μW입니다. 수지상 가시를 적절하게 샘플링하기 위해 약 80nm의 픽셀 크기를 설정합니다.
참고: 후속 분석에서는 노이즈가 수상돌기와 가시의 적절한 분할을 손상시키지 않는 이미지가 필요합니다. 위에서 언급한 공간 샘플링 및 전력 설정을 통해 3.15μs의 픽셀 체류 시간은 이러한 이미지를 구축하기에 충분한 광자를 수집하기에 충분하다는 것을 관찰했습니다. 희미한 샘플의 경우 평균 2-4회 스캔하여 이미지 품질을 향상시킬 수 있습니다. 관심 영역을 덮기 위해 여러 XY 타일을 획득해야 할 수 있으며, 처리하기 전에 함께 꿰매어야 합니다. - 전체 뉴런 부피를 샘플링하려면 150nm에서 300nm 범위의 Z 간격을 가진 Z-스택을 획득하여 20에서 30개의 Z 슬라이스를 생성합니다.
참고: 이러한 설정으로 달성된 측면 공간 해상도는 234nm이고 축 해상도는 591nm입니다. 여기에서 선택한 샘플링은 적절하지만 축 해상도가 이미지화할 가시의 가장 작은 크기보다 크기 때문에 분석은 수상돌기에서 측면으로 확장되는 가시를 선호합니다.
5. 3D 수지상 가시의 정량화
참고: 다음 섹션에서는 분석을 위한 Imaris 소프트웨어 사용에 대해 구체적으로 설명합니다. 유사한 결과를 제공할 수 있는 NeuronStudio 또는 Metamorph를 포함한 대체 구현이 존재합니다.
다음 키 설정을 사용합니다.
- 전처리 단계로서 가우스 필터링은 소프트웨어에서 제공하는 이미지 처리 기능을 통해 사용됩니다. 가우스 필터> 이미지 처리 > 스무딩을 통해 가우스 필터링을 수행합니다. 필터 너비를 XY의 픽셀 크기와 동일하게 설정합니다.
- 소프트웨어의 필라멘트 추적기 모듈을 사용하여 수상돌기의 반자동 추적을 수행합니다.
- 먼저 소프트웨어의 슬라이스 탭에 있는 거리 도구를 사용하여 수상돌기 직경을 추정합니다.
- Surpass 탭에서 필라멘트 도구를 클릭합니다. 더 나은 견고성을 위해 이 프로토콜은 반자동 추적에 의존합니다. 자동 생성 건너뛰기를 클릭합니다. 이제 모듈 인터페이스에 그리기 탭이 표시됩니다. 여기서 방법으로 AutoPath를 선택하고 유형으로 Dendrite를 선택하고 예상 수상돌기 직경을 입력합니다.
- 포인터의 선택 모드를 사용하여 커서를 상자로 바꿉니다. Shift 키를 누른 채 수상돌기 시작점을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 참고: 소프트웨어는 초기 계산을 수행합니다.
- 수상돌기를 따라 포인터를 이동합니다. 시작점(파란색 구로 표시됨)에서 가장 가능성이 높은 수상돌기 경로를 나타내는 노란색 선이 표시됩니다. Shift 키를 누른 채 수상돌기 끝점을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다.
- 자동화된 스파인 분할을 수행합니다. 참고: 추적된 수상돌기의 스파인은 모듈 인터페이스에 의해 자동으로 발견됩니다.
- 모듈 인터페이스에서 생성 탭을 클릭합니다. 재구축 드롭 리스트에서 수상돌기 직경 재구축을 선택하고 데이터 유지 상자를 선택합니다. 그런 다음 Rebuild를 클릭합니다.
- 세그먼트 볼륨이 실제 수상돌기 볼륨에 해당하도록 임계값을 설정합니다. 알고리즘으로 거리 맵에서 최단 거리를 선택합니다. 다음 버튼을 클릭합니다.
- 소프트웨어의 슬라이스 탭에 있는 거리 도구를 사용하여 가장 작은 스파인 헤드 직경과 최대 길이를 결정한 다음 초과 탭으로 돌아가서 매개변수를 입력합니다. 이 프로토콜의 경우 최소 직경의 경우 약 200 - 300 nm, 최대 길이의 경우 4 μm 값이 좋은 출발점입니다. Allow Branch Spines 상자를 선택하지 마십시오. 다음 버튼을 클릭합니다.
- 시드 포인트 임계값을 조정하여 스파인을 나타내는 파란색 점이 실제 스파인 헤드에 국한되도록 합니다. 다음 버튼을 클릭합니다. 참고: 코어 계산은 이제 완료되었으며 길어질 수 있습니다.
- 모듈 인터페이스의 도구 탭으로 이동하여 스파인을 분류합니다. Classify Spines를 클릭합니다. 프롬프트 사용자 인터페이스에서 다음과 같이 형태로 정의된 4개의 클래스가 있는지 확인합니다. 스터비: 길이 <1μm; 버섯: 길이(척추) >3 및 최대 너비(머리)>평균 너비(목) x 2; 길고 얇은: 평균 너비(머리) ≥ 평균 너비(목); 사상체와 유사: 길이 ≤ 4μm(머리 없음). 참고: 모듈 인터페이스는 분류 결과를 포함하는 4개의 새 필라멘트 개체를 생성합니다.
- 통계 데이터 내보내기: 이 네 가지 객체 인터페이스 중 하나에서 통계 탭으로 이동합니다. 모든 통계를 파일로 내보내기 버튼을 클릭합니다.
참고: 수상돌기(예: 길이, 면적, 평균 직경, 가지 깊이, 분기 각도, 부피 등) 및 스파이(예: 직진도, 부착 면적, 개별 스파인 부분의 길이 및 부피, 척추 직경, 밀도 등).