배양된 성상세포에서 화물의 세포내 수송 시각화

초록

출처: Creighton, BA, et al. 성상세포에서 소기관 및 기타 화물의 세포내 수송을 시각화하고 분석합니다. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 산성 엔도리소좀 소포를 선택적으로 표지하는 형광 산향성 프로브를 사용하여 배양된 성상세포에서 세포내 화물 수송의 시각화를 보여줍니다. 공초점 현미경을 사용한 타임랩스 이미징 및 Z-스택 획득을 통해 3차원 세포 부피 전체에 걸쳐 형광 표지된 화물을 추적할 수 있습니다. 이 분석은 고정된 화물과 세포 주변이나 핵으로 이동하는 화물을 구별하여 세포 내 수송 역학에 대한 통찰력을 제공합니다.

프로토콜

1. 형광 태그가 지정된 플라스미드의 형질감염

1. 형질감염 또는 라벨링 전날, 형질감염 후 24-48시간 이미징을 위해 원하는 밀도로 성상세포를 시드합니다. 24웰 플레이트 또는 14mm 유리 바닥 웰의 권장 밀도는 2 x 104 세포/웰입니다.
   참고: 이 프로토콜은 지방 접시 기반 방법을 사용하여 24웰 플레이트 또는 14mm 유리 바닥 웰의 12mm 유리 커버슬립에 도금된 성상세포의 형질감염에 최적화되어 있습니다. 시약은 성상세포가 자라는 배양 접시의 크기에 따라 크기를 조정해야 합니다.
2. 지방 섬유 시약(재료 표)을 환원 혈청 배지(재료 표)에 희석합니다. DNA에 대한 지방 시약의 비율을 최적화하려면 적절한 희석액 범위를 테스트하십시오. 예를 들어, 이 프로토콜(재료 표)에 사용된 시약을 사용하는 경우, 50μL의 환원 혈청 배지에서 2, 3, 4 및 5μL의 지방 증식 시약
을 희석합니다.
3. 250μL의 환원 혈청 배지에 5μg의 고순도 DNA를 희석합니다. 5 μL의 lipofection enhancer 시약을 첨가합니다( 재료 표). 지방 섬유 시약이 들어 있는 튜브를 동일한 부피의 DNA-지방 섬유 강화제 혼합물과 결합합니다. 피펫팅으로 혼합하고 실온(RT)에서 15분 동안 배양합니다.
4. 성상세포 배양 배지를 제거하고 형질감염 혼합물(단계 1.3)을 세포에 적가하여 추가합니다. 37°C 및 5% CO2에서 6시간 배양한 후, 형질감염 복합체를 적절한 부피의 성상세포 배양 배지(14mm 유리 바닥 접시의 경우 2mL)로 교체합니다. 이미지 획득을 진행하기 전에 추가로 24-72시간 동안 배양합니다. 단백질 발현과 세포 생존력 사이의 최상의 균형을 달성하기 위해 배양 단계의 기간을 면밀히 모니터링합니다.

2. 형광 프로브를 이용한 후기 엔도좀/리소좀의 표지

참고

: 일부 화물은 화물 특이적 단백질에 대한 친화력이 높은 형광 염료를 사용하여 표지할 수 있습니다. 다음 예는 형광 산향성 프로브를 사용하여 후기 엔도좀/리소좀의 라벨링을 허용합니다.

1. 리소좀 표지 프로브( 재료 표)를 200 μL의 성상세포 배양 배지에서 1 μM의 작동 농도로 희석하고 2 x 104 세포/웰의 밀도로 1.1단계의 성상세포에 적용합니다. 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
2. 따뜻한 성상세포 배양 배지로 세포를 한 번 세척하고 이미징 배지로 교체합니다(재료 표). 즉시 라이브 이미징을 진행하십시오.

3. 타임랩스 이미징 시스템을 사용한 이미지 획득

참고: 타임랩스 라이브 이미징은 고속 카메라, 확실한 초점, 배양 챔버 및 높은 개구수의 40x 오일 대물렌즈(예: Plan-Apochromat 1.4NA)가 장착된 형광 현미경을 사용하여 수행해야 합니다. 타임랩스 이미징에는 다양한 획득 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 현미경 시스템 및 획득 소프트웨어의 선택은 특정 연구 목표에 대한 가용성과 적합성을 기반으로 해야 합니다. 몇 가지 일반적인 지침은 다음과 같습니다.

1. 배양 챔버 또는 접시를 현미경 스테이지의 적절한 어댑터에 놓습니다. 낙후형광을 사용하여 형광 단백질을 발현하는 세포를 선택하거나 기록할 프로브를 선택합니다. 형광 샘플 조명을 조정하여 디지털 카메라를 사용하여 선택한 세포를 시각화합니다. 광표백 및 광독성을 유발할 수 있는 높은 조명의 사용을 피하십시오. 초점 및 줌을 조정합니다.
2. 줌 및 확정 초점 기능을 사용하여 300초에서 500초 사이의 시간 간격 동안 2초마다 1프레임의 주파수로 단일 Z-스택 타임랩스 시리즈를 획득합니다.
   참고: 트래피킹 역학(속도, 운동 주파수 등)은 관심 있는 단백질에 따라 달라지므로 획득 시간 경과에 대한 조정이 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 미토콘드리아는 리소좀보다 운동성이 떨어지고 자주 일시 중지됩니다. 이 경우 획득 매개변수를 800초 동안 5초마다 1프레임으로 조정하는 것이 더 적절합니다.
3. 타임랩스 이미지를 저장하고 AVI 또는 TIFF 스택 파일로 내보냅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbecco's modified Eagle Medium	Gen Clone	25-500
Fetal Bovine Serum	Gemini	100-106	Heat-Inactivated
FIJI (Fiji는 Just Image J)	NIH	버전 1.52i
가는 팁 핀셋	FST	11254-20	스타일 #5
형광 광원	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
유리 바닥 접시	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	35mm 접시 | No. 1.5 커버슬립 | 14mm 유리 직경 | 코팅되지 않은
Graefe 집게	FST	11054-10	곡선 끝이 있는 Graefe 홍채 집게
, 산성 구획(후기 엔도좀 및 리소좀)을 염색하는 녹색 형광 염료,	Life Technologies	L7526	LysoTracker Green DND 26. DMSOS에 1mM 원액에 미리 용해됩니다. 선택한 성장 배지 또는 완충액에서 최종 작동 농도로 희석합니다.
Hank's Balanced Salt Solution (10x)	Gibco	14065-056	마그네슘 및 칼슘 프리
이미징 미디어	Life Technologies	A14291DJ	Live Cell Imaging Solution
립 공초점 현미경	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer 시약	생명 기술	11514015	플러스 시약
Lipofection 시약	생명 기술	15338100	Lipofectamine LTX 시약
도 흔들림 인큐베이터	뉴브런즈윅 사이언티픽	8261-30-1008	Innova 4230, 온도 및 속도 제어를 가진 궤도 흔들림 인큐베이터
페니실린/스트레포마이신 용액 (100x)	Gen Clone	25-512
인산염 완충 식염수 (10x)	Gen Clone	25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromide	Sigma	P7405	Tris 완충액, pH 8.5에 1mg/mL로 용해합니다. 장기 보관을 위해 냉동하십시오. 냉동 및 해동 주기를 피하십시오
환원 혈청 배지	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
조직 배양 플라스크	Olympus Plastics	25-209	75 cm^2. 100% 각진 목 접근, 0.22um 소수성 통풍 필터 캡
조직 배양 인큐베이터	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i, 온도, 습도 및 CO2 제어
기능이 있는 조직 배양 인큐베이터Tris-Base	Sigma	T1503	8.402g을 물에 1리터에 용해하여 4.829g Tris HCl을 사용하여 0.1 M Tris 완충액을 만들고, pH 8.5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4.829g을 물에 1리터에 용해하여 8.402g Tris Base를 사용하여 0.1M Tris 완충액을 만들고, pH 8.5

, , 도 궤