방법 논문

마우스 뇌 절편에서 혈액-뇌 장벽의 고해상도 3차원 공초점 이미징

2025년 6월 18일

이 논문에서

초록

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출처: Villaseñor, R 및 Collin. L. 혈액뇌장벽의 고해상도 공초점 영상: 영상화, 3D 재구성 및 전세포증의 정량화. J. Vis. 경험. (2017년)

이 비디오는 공초점 현미경을 사용하여 혈액뇌장벽(BBB)의 고해상도 3D 이미징을 보여주며, 뇌 항상성, 신경혈관 상호 작용 및 질병 관련 BBB 기능 장애를 연구하는 데 적용할 수 있는 BBB 구성 요소 및 세포내 구조를 분석하기 위해 항체 염색된 마우스 뇌 절편을 보여줍니다.

프로토콜

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동물 샘플과 관련된 모든 절차는 적절한 동물 윤리 검토 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다.

  1. 혈액뇌장벽의 고해상도 공초점 이미징
  2. 빛 스펙트럼의 파란색, 녹색, 주황색 및 빨간색 영역에서 형광단을 여기시키기 위해 405, 488, 561 및 633nm의 레이저 라인이 있는 적절한 레이저 스캐닝 공초점 현미경( 재료 표 참조)으로 이미지 획득을 수행합니다. 이미지 획득을 위해 개구수가 1.4인 63X 오일 대물렌즈를 사용하십시오.
  3. 현미경을 제어하는 소프트웨어의 획득 메뉴에서 이미지 획득 매개변수를 설정합니다. '이미지 크기' 드롭다운 메뉴에서 1024 x 1024픽셀 값을 선택합니다. '확대/축소' 메뉴의 값을 조정하여 픽셀 크기를 200nm에서 300nm 사이의 값으로 수정합니다."
    참고: 세포내 구조를 분석하려면 픽셀 크기를 75nm로 줄입니다. 이 이미지 크기 설정은 획득 시간을 크게 늘리고 더 작은 시야를 이미징하여 획득 시간을 줄이기 위해 512 x 512 픽셀로 줄일 수 있습니다.
    4. '
  4. 획득 속도' 드롭다운 메뉴에서 400Hz 값, 즉 초당 400라인을 선택합니다. '시스템 설정' 메뉴에서 '픽셀 깊이' 드롭다운 메뉴를 선택하고 값을 12비트로 변경합니다.
  5. 현미경 소프트웨어의 '획득' 탭 내에서 순차 프레임 획득 옵션을 켭니다. '핀홀' 메뉴의 값을 수정하여 각 채널에 대해 광학 단면 두께를 0.75에서 1μm 사이의 값으로 설정합니다.
  6. 형광 여기용 패널에서 샘플의 형광단을 최적으로 여기시키는 데 필요한 레이저(예: 녹색 방출 형광단용 488nm 레이저 라인)를 활성화합니다.
    참고: 형광단 스펙트럼 뷰어( 재료 표 참조)를 사용하여 적절한 여기 레이저를 선택하십시오.
  7. 형광 검출 패널에서 슬라이더를 움직여 각 채널에서 측정할 파장을 선택합니다(예: 녹색 방출 형광단의 경우 510에서 550nm 사이).
    참고: 형광단 스펙트럼 뷰어( 재료 표 참조)를 사용하여 적절한 검출 파장을 선택하십시오.
  8. 유리 커버슬립과 대물렌즈의 굴절률과 일치하도록 뇌 섹션이 있는 커버슬립 위에 굴절률이 1.52인 침지 오일 한 방울을 추가합니다. 샘플을 현미경에 넣고 낙산화형광등을 켜서 현미경 쌍안경을 사용하여 샘플을 시각화합니다.
  9. 현미경 스탠드의 버튼을 사용하여 필터 휠을 변경하여 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 염색 핵을 시각화하는 데 적합한 필터를 선택합니다. 거친 초점을 사용하여 DAPI로 염색된 핵의 신호에 초점을 맞춥니다.
  10. 현미경 스탠드의 버튼을 사용하여 필터를 변경하여 혈관 마커(예: CollagenIV 또는 CD31)의 신호를 시각화하고 개별 모세혈관 세그먼트의 시야를 중앙
    11. 에 배치합니다.
  11. 버튼을 눌러 라이브 스캔 모드를 시작합니다. 스캔하는 동안 각 채널의 게인과 레이저 강도를 조정하여 이미지의 동적 범위를 최대화하고 픽셀 포화를 방지하십시오.
    참고: 포화 픽셀에 레이블을 지정하는 조회 테이블을 사용하여 과포화를 시각적으로 평가하십시오. 신호 과포화를 방지하려면 형광 신호가 가장 높을 것으로 예상되는 샘플로 설정을 조정하십시오.
  12. 라인 평균화 값을 2.
    참고: 더 높은 획득 속도를 사용하는 경우 이 값을 늘려 노이즈를 줄이십시오.
  13. 모세관의 전체 부피에 걸쳐 광학 z-스택을 수행하기 위한 시작 및 종료 섹션을 설정합니다. 0.45 μm.
    의 스텝 크기를 사용하십시오. 참고: 이미지를 후속 정량화에 사용하는 경우 전체 데이터 세트에 대해 동일한 획득 설정을 유지하십시오.
  14. 정량화를 위해 통계적 비교를 위해 최소 3마리의 서로 다른 마우스로부터 섹션당 10-20개의 z-스택을 획득합니다.
    참고: 샘플 표백 및 레이저 강도 변동으로 인해 발생하는 변동성을 줄이기 위해 동일한 세션에서 전체 데이터 세트를 획득합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Novus Biologicals MCA2388 Labels에 대한 쥐 단클론 항체 클론 ER-MP12희석 1:100에서 사용 희석 1:400에서 사용되는 적절한 AlexaFluor 염료와 결합된 당나귀 다클론 항쥐 IgG(H+L)로 검출
PodocalyxinR&D SystemsMAB1556Labels 모세혈관의 루멘에 대한 쥐 단클론 항체 희석 1:100 희석 1:100에서 사용 당나귀 다클론 항쥐 IgG(H+L)와 적절한 AlexaFluor 염료 결합으로 검출
BiotrendBT21-5014-70에 대한끼 다클론 항체라벨 모세혈관 기저막희석 1:100에서 사용당나귀 다클론 항토끼 IgG(H+L)와 적절한 AlexaFluor 염료 결합으로 검출, 희석 1:400 사용
R&D SystemsAF2335대한 염소 다클론 항체위 세포 라벨 희석 1:100희석에서 사용희석 1:400에서 사용 당나귀 다클론 항염소 IgG(H+L)와 적절한 AlexaFluor 염료 결합으로 검출
Cy3Abcamab49874희석 1:100
Iba-1에 대한 토끼 다클론 항체Wako019-19741표지 미세아교세포 희석 1:100에서 사용 당나귀 다클론 항쥐 IgG (H+L) 및 적절한 AlexaFluor 염료와 결합하여 1:400 희석 시 사용
단클론 항체 ABL93 gainst LAMP2Fitzgerald10R-CD107BBMSP라벨 리소좀희석 1:100에서 사용당나귀 다클론 항쥐 IgG(H+L)와 적절한 AlexaFluor 염료 결합, 희석 1:400 쥐
IgG에 대한 당나귀 다클론 항체(H+L) AlexaFluor594 LifeTechnologiesA21203희석 1:400에서 사용
마우스 IgG(H+L)에 대한 당나귀 다클론 항체 AlexaFluor488LifeTechnologiesA21202희석 1:400
에서 사용마우스에 대한 염소 다클론 항체 IgG (H+L) AlexaFluor555LifeTechnologiesA21422희석 시 사용 1:400
형광 마운팅 매체DakoS3023Dako 형광 마운팅 매체
레이저 스캐닝 공초점 현미경라이카 마이크로시스템즈 NA라이카 TCS SP8 X HyD 검출기 및 백색광 레이저
이미지 처리 소프트웨어라이카 마이크로시스템즈 NA라이카 Application Suite AF 버전 3.1.0 빌드 8587
이미지 분석 소프트웨어비트플레인 과학 소프트웨어NA어용 Imaris 버전 7.6.5 빌드 31770
ThermoFisher ScientificNAhttps://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html
CD31/PECAM Brain Endothelial Cells콜라겐IV 토CD13 에 주 표지 성상세포에 결합된 GFAP에 대한 마우스 단클론 항체 클론 G-A-5 쥐 x64 형광 스펙트럼뷰

재인쇄 및 허가

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