비율계량 지표를 사용하여 1차 뉴런의 미토콘드리아 산화환원 상태 이미징

초록

출처: Katsalifis, A., et al. 비율계량 지표를 사용하여 일차 뉴런에서 미토콘드리아 글루타티온 산화환원 상태의 실시간 이미징. J. Vis. 경험. (2021년)

이 비디오는 비율계량 형광 지시약을 사용하여 1차 뉴런에서 미토콘드리아 산화환원 상태의 이미징을 보여줍니다. 형광 현미경으로 두 가지 여기 파장을 적용하여 형광 강도 비율을 측정하여 미토콘드리아 산화를 평가합니다. 이 프로토콜에는 칼슘 유입 및 활성 산소종(ROS) 생성을 유도하기 위한 N-메틸-D-아스파르테이트(NMDA) 자극과 NMDA 유도 미토콘드리아 산화를 정량화하기 위한 산화제 및 환원제를 사용한 보정이 포함됩니다.

프로토콜

1. 테트라메틸로다민 에틸 에스테르 과염소산염(TMRE)으로 셀 로딩 참고

: 이 프로토콜에서 TMRE는 최종 농도 20nM에서 비담금질 모드에서 사용됩니다. 일반적으로 선택한 현미경에서 여전히 충분한 신호 강도를 제공하는 가능한 가장 낮은 농도의 TMRE를 사용해야 합니다. 고르지 않은 증발로 인해 서로 다른 우물의 배지 부피는 장기 1차 배양에서 다를 수 있습니다. 모든 웰에서 일관된 TMRE 농도를 보장하려면 TMRE를 웰에 직접 추가하지 마십시오. 대신 각 웰의 배지를 동일한 양의 TMRE 함유 배지로 교체하십시오. 아래 프로토콜은 웰당 ~1mL의 배지를 포함하는 24웰 플레이트의 1차 뉴런용으로 설계되었습니다.

1. 조직 배양 층류 후드에서 작업하면서 각 웰에서 500μL의 배지를 단일 원추형 튜브로 수집합니다.
2. 웰당 0.5μL의 20μM TMRE 스톡을 원추형 튜브에 추가합니다(예: 24웰의 경우 12μL).
3. 첫 번째 웰에서 남은 배지를 조심스럽게 흡인하고 500μL의 TMRE 함유 배지로 교체합니다. 나머지 우물로 웰 단위로 계속하십시오.
   참고: 세포가 마르지 않도록 주의하고 세포를 방해하지 않도록 주의하십시오.
4. 세포를 인큐베이터로 되돌리고 염료 평형화를 위해 최소 60분 동안 기다립니다.
   참고: 로딩 시간은 부작용 없이 몇 시간으로 연장될 수 있습니다.
5. 이미징 실험 전반에 걸쳐 일관된 TMRE 농도 및 평형을 보장하려면 이미징 버퍼 및 모든 자극 용액에 20 nM TMRE의 최종 농도를 포함해야 합니다.

2. 스캐닝 공초점 현미경 설정의 최적화

참고: 이 단계는 라이브 이미징 중에 이미지 품질과 세포 생존력 사이의 최상의 절충안을 찾는 것을 목표로 합니다. 이 섹션에서는 환원-산화 민감성 녹색 형광 단백질(roGFP) 이미징을 위한 설정 최적화에 대해 설명합니다. 다중 매개변수 이미징을 수행하는 경우 표백 또는 광독성의 징후 없이 안정적인 기준선을 확인하는 것을 포함하여 추가 지표에 대해 유사한 최적화를 수행해야 합니다.

1. 컨포칼 현미경을 시작하고 GFP 이미징을 위한 표준 설정(488 nm 여기, 505 - 550 nm 방출)을 로드합니다.
2. 감지기를 12비트 또는 16비트로 설정합니다. 메모: 일반적으로 정량적 이미징에는 8비트로는 충분하지 않습니다.
3. 순차 스캔 모드를 활성화하고 두 번째 시퀀스/트랙(405 nm 여기, 505 - 550 nm 방출)을 추가합니다.
4. 두 채널 모두에 대해 과다 노출 및 과소 노출 픽셀(예: GLOW OU)을 나타내는 의사 색상 조회 테이블을 선택합니다.
5. 관심 대상에 적합한 대물렌즈를 선택하십시오.
   참고: 10x-40x는 단일 세포 분석에 적합하고 63x-100x는 단일 미토콘드리아 분석에 적합합니다.
6. 세포가 담긴 커버슬립을 이미징 챔버에 장착하고 이미징 완충액 1mL를 추가한 다음 챔버를 현미경에 놓습니다.
7. 접안렌즈와 투과광을 사용하여 세포의 초점을 맞춥니다.
   참고: 세포를 찾고 초점을 맞추기 위해 낙현형광을 사용하지 마십시오. 저전력에서도 이는 세포에 부정적인 영향을 미칩니다.
8. 다양한 픽셀 형식으로 이미지를 기록합니다. 이러한 이미지를 기반으로 관심 구조의 허용 가능한 해상도를 제공하는 가장 낮은 픽셀 수를 선택합니다.
   참고: 일반적으로 512 x 512 픽셀은 20x 및 40x 대물렌즈를 사용하는 단일 세포 이미징에 적합하며 1024 x 1024 또는 2048 x2048 픽셀은 일반적으로 63x 대물렌즈를 사용하는 단일 미토콘드리아 이미징에 적합합니다.
핀
9. 홀 크기가 다른 이미지를 기록합니다. 이 이미지를 기반으로 관심 구조의 허용 가능한 해상도를 제공하는 가장 큰 핀홀 크기를 선택합니다.
   참고: 일반적으로 3-7개의 통풍이 잘되는 장치가 잘 작동합니다.
10. 다양한 레이저 강도로 이미지를 기록합니다.
    1. 그에 따라 감지기 게인과 임계값을 조정합니다. 이러한 이미지를 기반으로 허용 가능한 신호 강도와 신호 대 배경 비율을 제공하는 가장 낮은 레이저 강도를 선택합니다.
       1. 신호 대 배경 비율을 결정하려면 세포 또는 미토콘드리아(ROI1)가 포함된 관심 영역(ROI)과 세포 또는 미토콘드리아가 없는 ROI(ROI2)에서 신호 강도를 측정합니다. 그런 다음 ROI1의 강도를 ROI2.참고: 1-3% 레이저 출력으로 405nm 여기의 경우 신호 대 배경 >비율 200-1,000, 1% 레이저 출력으로 488nm 여기의 경우 개별 ROI의 강도를 300-1,500
으로 나눕니다.
11. 스캔 속도와 프레임 평균 수가 다른 이미지를 기록합니다. 각 설정 조합에 대해 4-5개의 이미지를 기록합니다. 이러한 이미지 시리즈를 기반으로 허용 가능한 이미지 노이즈 및 이미지 간 변동성을 제공하는 최고 속도 및 최저 평균 설정을 선택합니다.
    참고: 대부분의 경우 600Hz의 스캔 속도와 평균화를 위한 1-2프레임이 잘 작동합니다.
12. 새 커버슬립을 사용하여 최적화된 설정으로 타임랩스 시리즈를 기록합니다.
    참고: 시리즈의 지속 시간과 이미지 간격은 계획된 실험의 지속 시간과 유사해야 합니다.
13. 타임랩스 시리즈가 끝나면 기록 챔버에 1mL의 2x 디아미드(DA) 용액을 추가합니다. 추가 2분 동안 이미지.
14. 연동 펌프 또는 휴대용 피펫을 사용하여 이미징 완충액을 흡인합니다. 1x 디티오트레이톨(DTT) 용액 1mL를 첨가합니다. 추가 5분 동안 이미지.
15. 타임랩스 실험을 분석합니다.
    1. 최적화된 설정을 사용하여 DA 및 DTT 처리 중에 두 채널 중 어느 것도 과다 노출되거나 노출 부족하지 않는지 확인합니다.
    2. 타임랩스 녹화 중에 두 채널 중 어느 것도 상당한 표백을 보이지 않는지 확인하십시오. 첫 번째 이미지와 마지막 이미지 사이의 강도 손실이 <2%를 목표로 합니다.
    3. 이미징 중에 405:488 비율이 크게 변하지 않는지 확인합니다.
허용
16. 가능한 결과를 일관되게 제공하는 설정이 정의될 때까지 여러 커버슬립을 사용하여 전체 절차를 반복적으로 반복합니다.

3. 기초 산화환원 상태 평가

1. 현미경을 시작하고 섹션 2에서 최적화된 설정을 로드합니다.
2. 프레임 평균을 3-5로 설정합니다.
3. 세포가 담긴 커버슬립을 이미징 챔버에 장착하고 이미징 완충액 1mL를 추가한 다음 챔버를 현미경에 놓습니다.
4. 접안렌즈와 투과광을 사용하여 세포의 초점을 맞춥니다.
   참고: 세포를 찾고 초점을 맞추기 위해 낙현형광을 사용하지 마십시오. 저전력에서도 이는 세포에 부정적인 영향을 미칩니다.
5. 스캐닝 모드로 전환하고 라이브 뷰에서 488nm 채널을 사용하여 이미징을 위해 세포에 초점을 맞추고 찾습니다.
6. 다지점 기능을 사용하여 커버슬립에서 3-5개의 시야를 선택합니다.
7. 기준선 이미지를 기록합니다.
8. 2x DA 용액 1mL를 챔버에 추가합니다.
9. 1분, 2분, 3분 후 라이브 뷰를 사용하여 초점을 확인/조정한 다음 이미지를 기록합니다.
   참고: 세포는 일반적으로 2분 후에 완전히 산화됩니다.
10. 이미징 챔버의 완충액을 1mL의 1x DTT 용액으로 교체합니다.
11. 3분 및 5분 후 라이브 뷰를 사용하여 초점을 확인/조정한 다음 이미지를 기록합니다.
    참고: 세포는 일반적으로 4-5분 후에 완전히 감소합니다.

4. 급성 치료의 실시간 이미징

참고: 아래 프로토콜은 NMDA 치료에 대한 미토콘드리아 산화환원 반응의 이미징을 설명합니다. 실험의 이미지 간격과 기간은 다른 처리를 위해 조정해야 할 수 있습니다.

1. 현미경을 시작하고 섹션 3에서 최적화된 설정을 로드합니다.
2. 타임랩스 간격을 30초로 설정하고 지속 시간을 25분으로 설정합니다.
3. 세포가 담긴 커버슬립을 이미징 챔버에 장착하고 이미징 완충액 1mL를 추가한 다음 챔버를 현미경에 놓습니다.
   참고: 열 초점 드리프트를 방지하려면 타임랩스 이미징을 시작하기 전에 세포를 현미경 스테이지에 10-15분 동안 그대로 두십시오.
4. 접안렌즈와 투과광을 사용하여 세포의 초점을 맞춥니다.
   참고: 세포를 찾고 초점을 맞추기 위해 낙현형광을 사용하지 마십시오. 저전력에서도 이는 세포에 부정적인 영향을 미칩니다.
5. 스캐닝 모드로 전환하고 라이브 뷰에서 488nm 채널을 사용하여 이미징을 위해 세포에 초점을 맞추고 찾습니다.
6. 선택 사항: 실행당 기록된 셀 수를 늘리려면 다점(multipoint) 기능을 사용하여 커버슬립당 2-3개의 시야를 이미지화합니다.
7. 타임랩스 획득을 시작하고 5개의 이미지를 2분 기준 기록으로 기록합니다.
8. 500μL의 3x NMDA 용액을 챔버(최종 농도 30μM)에 추가하고 10분 NMDA 반응으로 추가 20개의 이미지를 기록합니다.
   참고: 뉴런은 삼투압의 변화에 매우 민감합니다. 따라서 이미징 버퍼의 증발을 최소화해야 합니다. 장기간 치료하려면 이미징 챔버를 뚜껑으로 덮어야 합니다.
9. 500μL의 4x DA 용액을 챔버에 추가하고 6개의 이미지를 더 기록합니다(최대 보정 3분
).
10. 이미징 챔버에서 완충액을 흡인하고 1mL의 1x DTT 용액으로 교체합니다. 10개의 이미지를 더 기록합니다(최소 보정 5분).
11. 녹화를 종료하고 이미지 시리즈를 저장합니다.

재료