마우스 뇌에서 인간 신경 전구 세포의 생체 내 생물 발광 이미징

초록

출처: Weber, R. Z., et al., 마우스 뇌에서 인간 신경 전구 세포의 뇌내 이식 및 생체 내 생물 발광 추적. J. Vis. 경험. (2022년)

이 비디오는 마우스 뇌에 주입된 유전자 변형 인간 신경 전구 세포의 생체 내 생물 발광 이미징 방법을 보여줍니다. 이 과정에는 루시페린 주입, 이미징 준비 및 주사 부위에 이식된 세포의 생물 발광 신호 검출이 포함됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

생체 내 이미징

1. 루시페린의 준비
   실
   1. 온(RT)에서 D-루시페린 칼륨염을 해동하고 PBS에서 30mg/mL의 D-루시페린의 신선한 원액을 준비합니다.
   2. 0.22μm 주사기 필터를 통해 원액을 멸균합니다.
      참고: 작업 용액을 즉시 사용하는 것이 좋습니다. 필요한 경우 용해된 루시페린을 -20°C에서 보관할 수 있습니다. 그러나 장기간 보관하면 신호가 저하될 수 있습니다. 루시페린은 빛에 민감한 시약입니다. 가능하면 직사광선을 피하십시오. 분해능 한계를 개선하기 위해 대체 기질, 예를 들어 cycluc도 고려될 수 있습니다.
2. Imaging
   1. 초기 설정
      참고: 생물발광 이미징은 어두운 챔버와 냉각 전하 결합 소자(CCD) 카메라로 구성된 생체 내 이미징 시스템(재료 표 참조)을 사용하여 수행되었습니다.
      1. Living Image 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하고 드롭다운 목록에서 사용자 ID를 선택합니다.
      2. 표시되는 제어판에서 초기화를 클릭합니다. 초기화 프로세스가 완료되면 제어판의 온도 상자가 녹색으로 바뀝니다.
      3. 제어판에서 발광 및 사진 상자를 선택하고 자동 노출(~60초)을 선택합니다. 시야를 선택합니다(이 프로토콜의 경우 D/12.5cm가 선택됨). 피사체 높이(1.5cm)를 입력하고 피사체 높이 초점 사용 옵션을 선택합니다. 큰 비닝, f/2, 차단된 여기 필터 및 개방 방출 필터와 같은 매개변수를 수동으로 설정합니다.
   2. 300mg/kg 체중에서 D-루시페린의 주사량을 결정합니다.
      참고: 표준 권장 용량은 D-루시페린 150mg/kg입니다. 이 절차는 300mg/kg을 사용하여 더 높은 민감도를 보고하는 프로토콜에 따라 조정되었습니다.
   3. 루시페린을 복강내(i.p.)로 주사합니다.
      참고: 주사 전에 동물에게 진정제를 투여해야 하는 경우, 피크 루시페라제 발현 시간이 연장될 수 있다는 점에 유의하십시오.
   4. 5분 동안 기다린 다음 이소플루란(이미징 절차 중 유도 단계에서 4.5%, 유지 단계에서 1.5-2%)을 지속적으로 공급하여 동물을 마취합니다.
   5. 눈에 안과용 윤활제를 바른 다음 기존 면도기를 사용하여 진정된 동물의 머리 부위를 면도합니다. 동물을 이미징 챔버에 넣고 루시페린 주사 후 15분 후에 제어판에서 획득을 클릭하여 이미징을 시작합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소모품
주사기 필터; 0.22 μm	TPP	99722
장비
가열 패드			선택 제품
체 내 이미징 시스템(IVIS Lumina III with Living Imaging 4.2 소프트웨어 패키지)	Perkin Elmer	CLS136334
이소플루란 기화기	Provet AG	330724
및 시약
-루시페린 칼륨 염	Perkin Elmer	122799
에탄올; 70%			선택 제품
: 이소플루란(이소플루란(1-클로르-2,2,2-트리플루오로에틸-디플루오로메틸에테르) 99.9%)	Provet AG	모든 의약품은 스위스 취리히의 주 약국에서 제공했습니다
		모든 의약품은 스위스 취리히에 있는 주 약국에서 제공했습니다

생 제약 D: . Ophtalmic 윤활제(레티놀 팔미타트: 15,000 UI)Bausch & Lomb Swiss AG