마우스 뇌 조직에서 수초 뉴런을 시각화하기 위한 Coherent Anti-Stokes Raman 분광법

초록

출처: McCullagh, E. A., et al. 뇌 절편의 수초화 이미징을 위한 CARS(Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy) 적용. J. Vis. 경험. (2022년)

이 비디오는 설치류 뇌 조직의 신경 구조를 시각화하기 위한 형광 및 CARS(Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy) 이미징을 보여줍니다. Nissl 염색은 리보솜 RNA에 결합하여 세포체를 표지하는 반면, CARS 이미징은 레이저 유도 신호를 통해 지질이 풍부한 미엘린을 표적으로 삼습니다. 형광 및 CARS 이미지를 오버레이하면 세포체와 수초가 있는 축삭에 대한 자세한 보기를 제공합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 적절한 동물 윤리 검토 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다.

1. 염색

1. Nissl용 염색 자유 부유 절편, 항체 배지(AB 배지: 0.1 M 인산염 완충액(PB: 50 mM KH2PO4, 150 mM Na2HPO4), 150 mM NaCl, 3 mM Triton-X, 1% 소 혈청 알부민(BSA))에서 표준 실험실 셰이커에서 실온에서 30분 동안 세포체를 시각화합니다><(1:100).
2. 알루미늄 호일 및/또는 커버를 사용하여 절편을 빛으로부터 보호합니다. 550nm 이하의 파장은 CARS 이미징과 호환됩니다(그림 1).
   참고: Triton-X 또는 기타 시약이 지질의 CARS 이미징에 영향을 미칠 것으로 예상하지는 않지만 특정 항체 배지를 사용한 추가 대조군이 필요할 수 있습니다.

일시 중지 지점: 이미징이 있을 때까지 자유 부유 절편(빛으로부터 보호되는 동안)을 인산염 완충 식염수(PBS)에 보관합니다. 절편이 완료되면 2주 이내에 뇌 절편을 이미지화합니다.

2. 이미징

참고: CARS 레이저 설정에는 80MHz 클럭을 제공하는 파이버 레이저와 770-990nm의 조정 가능한 범위를 가진 OPO(광학 파라메트릭 발진기) 레이저가 포함되어 있으며 스톡스 빔은 1031nm로 고정되어 있어 CARS 신호를 수집하는 데 필요합니다. 두 빔 모두에 하나의 구멍이 있습니다.

1. 샘플을 현미경으로 가져오기 전에 CARS 레이저를 켜고 최소 1시간 동안 예열하고 CARS 레이저를 정렬하고 Koehler를 전방 CARS 이미징을 위해 콘덴서 광학 장치와 현미경의 다이어프램을 정렬합니다.참고: 이 단계는 CARS 현미경 검사의 적절한 기능에 매우 중요합니다.
   1. 두 개의 레이저 빔(펌프 및 스토크)의 공간 정렬을 위해 CARS 레이저 GUI(그래픽 사용자 인터페이스)를 통해 두 개의 내부 PSD(위치 감지 감지기)에 액세스합니다.
   2. 파장이 다르기 때문에 분산이 다른 두 레이저(펌프 및 스토크)의 펄스를 겹치는 데 도움이 될 수 있는 CARS 레이저 GUI의 지연 기능을 사용하여 시간적 정렬을 달성합니다. 따라서 펌프 빔과 스토크 빔의 시간적 및 공간적 중첩은 모두 GUI를 통한 사용자 입력으로 수행됩니다.
   3. 외부 잠망경(설정의 마지막 두 미러)을 조정하여 공간적으로 겹친 두 개의 레이저를 현미경의 스캐닝 헤드 미러 중앙에 배치합니다.
   4. 최상의 전방 CARS 비디스캔 감지를 위해 콘덴서가 Koehler-ed인지 확인하십시오(즉, 콘덴서가 중앙에 있고 균일한 조명을 얻기 위해 다이어프램에 초점을 맞추고 있음).
2. 면역형광 공초점 이미징 및 CARS 이미징의 경우, 형광 이미징을 위한 가시광선 레이저가 장착된 공초점 현미경을 통합하여 전방 및 에피 CARS 비디스캔 검출기(NDD)와 함께 CARS 레이저를 장착합니다(그림 2).
3. 커버슬립(도립 현미경용), 조직이 건조되지 않도록 PBS, 조직을 커버슬립 근처에 유지하기 위해 유리 추가 있는 배양 접시에 절편을 넣습니다.
4. 사다리꼴체(MNTB)의 내측 핵과 같은 뇌 영역을 이미징하기 위해 에피 방향으로 CARS 신호를 수집하고 전방 방향으로 0.55 NA 콘덴서를 통해 60X, 1.2 개구수(NA) 적외선 보정 물 대물렌즈를 사용하여 z-스택 또는 단일 이미지를 촬영합니다.
   1. CARS 레이저 GUI를 사용하여 약 600mW 펌프/프로브 및 300mW Stokes에서 CARS 이미지를 가져옵니다. 이러한 레이저 출력 값은 시스템에 의해 내부적으로 측정됩니다. 샘플 위치에서 두 레이저 모두 25mW 미만이며 조직 샘플에 안전합니다.
   2. 펌프와 Stokes 빔을 공간적으로나 시간적으로 겹칩니다. OPO를 797.2nm로 조정합니다. 이것은 650nm의 CARS 파장을 생성합니다. 더 높은 에너지 준위로 인해 기저 상태로 돌아가는 것은 여기에 대한 반스토크스(파란색 이동)입니다.
   3. 대역 통과 필터(640-680nm)를 사용하여 epi 또는 순방향 비디스캔 검출기에서 CARS 신호를 캡처한 다음 면역형광 표지(이 경우 형광 표지된 Nissl)를 순차적으로 검출합니다. 메모: Nissl 신경 체세포 마커는 CARS 640-680nm 대역 통과 필터에 걸리지 않으므로 아래 제시된 이미지에서 형광과 CARS 이미징의 조합이 가능합니다.
   4. CARS와 형광은 PMT를 공유하지 않습니다. 최적의 지질 신호를 위해 이러한 설정을 사용하여 뇌 영역의 수초화를 선택적으로 이미지화합니다. 주의: 레이저 빔으로부터 사용자 보호
5. 이미지를 .oib 파일로 저장하면 추가 정량화를 위해 이미지 분석 프로그램으로 가져올 수 있습니다(그림 3).

결과

그림 1: CARS 이미징은 면역형광 이미징과 결합할 수 있습니다. 그래프는 CARS 이미징이 660/640nm 적색 신호 스펙트럼에서 발생함을 보여줍니다. 이 파장은 녹색, 파란색 또는 UV 범위에서 충분히 멀리 떨어져 있어 이러한 범위에서 CARS 신호와 면역형광의 조합이 가능합니다. 구체적으로, 그래프는 또한 이 간행물의 대표적인 결과를 수집하는 동안 CARS와 결합된 청색 형광단으로 태그된 Nissl의 여기 및 방출을 나...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염색:
AB 매체:			Millipore H2O 인산염(PB) 1n 1,000mL
:
인산칼륨 모노베이스	시그마	P5655
인소산나트륨 이염기성	시그마	S7907
BSA(소 혈청 알부민)	시그마 생명 과학	A2153-100g
염화나트륨	피셔 케미컬	s271-1
트리톤 X-100	시그마 - 알드리치	x100-500ml
Nissl 435/455	Invitrogen	N21479
CARS:
APE 피코에메랄드 레이저	Angewandte Physik &; Elektronik GmbH
대역 통과 필터(420-520 nm)	Chroma Technology	HQ470/100m-2P
대역 통과 필터(500-530 nm)	Chroma Technology	HQ515/30m-2P
대역 통과 필터(640-680nm)	크로마 테크놀로지	HQ660/40m-2P
공초점 현미경	올림푸스	FV1000
컷 트랜스퍼 피펫	피셔	13-711-7M
이색성 롱패스 565nm	크로마 테크놀로	565dcxr
다이크로틱 롱패스 585nm	로마 테크놀로	585dcxr
이색성 쇼트 패스 750 nm	크로마 테크놀로지	T750spxrxt
유리 바닥 배양 접시	MatTek	P35G-0-10-C
유리 무게 (10 mm x 10 mm 보로 로드)	Allen Scientific Glass Inc
다광자 쇼트 패스 방출 필터 680 nm	크로마 테크놀로지	ET680sp-2p8
PBS

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