유충 제브라피쉬의 측면 선 유모 세포에서 칼슘 역학 이미징

초록

출처: Lukasz, D., et al. 유충 제브라피쉬의 측면 선 유모 세포의 생체 내 칼슘 이미징. J. Vis. 경험. (2018년)

이 비디오는 공초점 현미경을 사용하여 마비된 형질전환 제브라피쉬 유충의 측면 선 유모 세포에서 칼슘 유입의 실시간 이미징을 보여줍니다. 유체 펄스를 통한 모발 다발의 기계적 자극은 기계적 전달 채널과 전압 개폐 채널을 통해 칼슘 유입을 유도하며, 이는 형광 지시약을 사용하여 실시간으로 시각화됩니다. 이 방법은 신경비만 유모 세포의 정점 및 기저 칼슘 역학을 강조하여 물 이동 감지에서의 역할을 밝힙니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 유충을 이미징 챔버에 고정 및 고정
   유충
   1. 이 움직이지 않거나 접촉에 반응하지 않을 때까지 이미징 챔버의 실리콘 캡슐화 표면에 0.04% MS-222를 함유한 약 1mL의 배아 완충액(E3) 완충액에 Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) 유충을 목욕시킵니다.
      1. 실체 현미경 아래에서 유충을 관류실의 중앙에 배치하여 실리콘 봉지재에 대해 옆으로 평평하게 눕도록 합니다.
         참고: 일관성을 위해 유충은 항상 같은 쪽(예: 오른쪽이 아래로, 왼쪽이 위로)에 장착됩니다(그림 2B1).
   2. 미세한 집게를 사용하여 0.035mm 헤드 핀을 유충과 챔버에 수직으로 가져옵니다. 헤드 핀을 눈과 이낭 사이와 캡슐화재에 삽입합니다(그림 1B1 및 1B2). 두 번째 집게 세트를 사용하여 고정하는 동안 유충의 등쪽 또는 복부를 따라 유충을 안정시킵니다. 핀의 수평 부분이 유충과 접촉하고 봉지재 안으로 완전히 누르지 않도록 하십시오. 핀을 복부로 기울이거나(그림 1B1) 물고기의 앞쪽을 약간 가리켜 후속 심장 주사 및 유모 세포 이미징을 방해하지 않도록 합니다.
      1. 집게를 사용하여 0.025mm 꼬리 핀을 꼬리 끝에 최대한 가까운 척삭에 삽입합니다(그림 1B1).
         참고: 유충이 늘어나지 않도록 주의하십시오. 유충을 평평하게 고정하십시오. 눈을 겹쳐야 합니다(그림 2B1). 이것은 심장 주사의 용이성(그림 1B2-B2', 단계 3), 바람직한 이미징 평면을 촉진하고(그림 1B1-B2'', 단계 5), 유체 제트 자극의 강도를 정량화하는 데 매우 중요합니다(그림 3A3, 단계 4).
2. 유충을 마비시키기 위해 심강에 α-Bungarotoxin을 주입

합니다.

알림: α-방가로톡신을 다룰 때는 장갑을 착용하십시오.

1. 심장 주사 바늘의 막힘을 방지하기 위해 사용하기 전에 α-방가로톡신 분취량을 잠시 원심분리하십시오.
   1. 겔 로딩 피펫 팁을 사용하여 3μL의 α-bungarotoxin 용액을 심장 주사 바늘에 다시 채웁니다. 기포 없이 용액을 팁에 고르게 로드합니다.
   2. 수동 마이크로 매니퓰레이터에 부착된 피펫 홀더에 심장 주사 바늘을 삽입합니다. 실체 현미경 아래에서 바늘이 고정되고 마취된 유충의 AP 축에 수직으로 정렬되어 ~30° 각도로 아래를 향하도록 배치합니다.
   3. 피펫 홀더를 압력 인젝터에 연결합니다. Pinjection = 100 hPa, tinjection = 0.5 s, Pcompensation = 5 hPa와 같은 제안된 설정을 적용합니다. 바늘 끝이 특허인지 테스트하기 위해 용액에 볼루스를 주입합니다.
   4. 바늘 끝을 남기기 위해 빨간색 용액(페놀 레드)의 작은 퍼프를 찾으십시오. 빨간색이 보이지 않으면 바늘 끝을 핀 가장자리에 대고 매우 부드럽게 긁어내고 바늘이 특허가 될 때까지 다시 시도하십시오. 또는 끝 구멍이 더 큰 바늘을 당깁니다.
2. 바늘이 심장 바깥쪽 피부에 닿을 때까지 바늘을 심장 쪽으로 앞으로 나눠줍니다(그림 1B2). 바늘을 유충에 밀어 넣고 심장 앞 피부의 색소 세포의 움푹 들어간 곳을 찾아 바늘이 유충에 대해 올바른 평면에 위치하는지 확인합니다(그림 1B2').
   1. 바늘이 피부를 관통하고 심장강에 들어갈 때까지 바늘을 더 앞으로 나눕니다. 바늘을 약간 뒤로 당깁니다. α-방가로톡신을 심장강에 일시 주입합니다. 심장강의 팽창이나 강에 들어가는 빨간색 염료를 찾으십시오.
유
3. 충을 1mL의 신경 완충액(NB)으로 부드럽게 3회 헹구어 잔류 MS-222를 제거합니다. 모든 유체를 제거하지 마십시오. 관류 챔버에서 약 1mL의 NB에 유충을 유지합니다.
   참고: 고정 및 심장 주사 후 및 전체 이미징 실험 동안 유충 심장 박동과 혈류가 견고하게 유지되는지 확인하십시오.
4. 현미경 및 유체 제트 설정 준비
   재료
   1. 표에 설명된 구성 요소를 사용하여 정립 공초점 현미경을 조립합니다: 488nm 레이저 및 적절한 필터가 있는 공초점 현미경, 이미징 및 자극을 제어하고 조정하는 현미경 소프트웨어, 10x 공기 대물렌즈, 60x 물 대물렌즈, 압전 Z 대물렌즈 스캐너(z-스택용), 고속 카메라, 원형 챔버 어댑터, 전동 스테이지 및 스테이지 인서트 어댑터.
   2. 진공 및 압력 펌프, 고속 압력 클램프 및 헤드 스테이지(재료 표에도 설명됨)의 3가지 주요 구성 요소로 구성된 유체 제트를 조립합니다. 고속 압력 클램프를 사용하여 헤드 스테이지에서 유체 제트 피펫으로 압력 또는 진공 배출의 타이밍과 지속 시간을 제어합니다.
      1. 벽이 두꺼운 실리콘 튜브를 통해 헤드 스테이지의 출력을 유체 제트 피펫 홀더에 연결합니다.
5. 유충과 유체 제트의 정렬

참고: 각 신경똥 내에는 3개의 관심 평면이 있습니다: (1) 모발 끝(그림 3A3: 자극 강도를 측정하는 데 사용되는 키노섬모); (2) 모발 다발 기계 전달(MET) 평면(그림 2B1-B1': MET 채널 의존성 칼슘 신호가 검출되는 정점 모발 다발의 기저부); 및 (3) 시냅스면(그림 2B2-B2': 시냅스 전 칼슘 신호가 유모 세포의 기저부에서 감지되는 곳). 이러한 평면은 그림 2A에 요약되어 있습니다.

1. 겔 로딩 팁을 사용하여 적절하게 파손된 유체 제트 바늘에 10μL의 NB를 다시 채웁니다. 기포 없이 용액을 팁에 고르게 로드합니다. 전동 마이크로 매니퓰레이터에 부착된 피펫 홀더에 바늘을 삽입합니다.
2. 관류 챔버를 현미경 스테이지의 원형 챔버 어댑터에 넣습니다. 메모: 일관성을 위해 유충을 항상 동일한 방향으로 배치하십시오(예: 유충이 포함된 챔버는 유체 제트를 향하고 복부 쪽은 실험자를 향합니다).
   1. 유충이 시야 중앙에 오도록 전동 스테이지를 이동합니다. 유충의 전후방(AP) 축이 유체 제트 바늘의 궤적과 대략 정렬되도록 원형 챔버 어댑터를 돌립니다.
   2. 투과광과 DIC(Differential Interference Contrast)를 사용하여 유충에 초점을 맞추고 10배 대물렌즈 아래 중앙에 배치합니다. 10배 목표를 올리세요.
3. 전동 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 유체 제트 바늘을 시야의 중앙으로 내려 투과된 빛에 의해 조명되고 NB 용액에 거의 닿지 않도록 합니다.
   1. 10배 목표를 낮춥니다. 유충의 위치를 확인하기 위해 유충에 초점을 맞춥니다. 유체 제트 바늘을 찾기 위해 초점을 맞추십시오. 물고기의 등쪽과 평행한 위치에 있을 때까지 x축과 y축에서 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 플루이드 제트 바늘을 움직입니다.
   2. 유충에 다시 집중하세요. 바늘을 z축에서 아래로 내립니다. 바늘을 물고기의 등쪽을 따라 몸에서 ~1mm 떨어진 곳에 놓습니다(그림 3A1).
   3. 원형 챔버 어댑터(필요한 경우)를 조심스럽게 움직여 유체 제트 바늘이 유충의 AP 정중선을 따라 정렬되도록 합니다(그림 3A1).
   4. 전동 스테이지를 움직여 관심 있는 뉴로마스트를 시야 중앙에 배치합니다. 유체 제트 바늘 끝을 물고기의 등쪽을 따라 유지하십시오. 유체 제트 바늘의 끝을 유충이나 챔버 표면에 만지지 마십시오.
4. 60배 물 대물렌즈로 전환합니다. 대물렌즈가 NB 용액에 잠겨 있는지 확인하십시오. 미세 초점을 사용하여 투과광과 DIC 광학을 사용하여 뉴로마스트를 찾습니다.
   참고: 이 설정은 일차 후방 측면선을 따라 뉴로마스트를 자극하도록 설계되었습니다. 이 뉴로비스트 내의 유모세포는 전방 또는 후방 유도 체액 흐름에 반응합니다.
   1. 마이크로 매니퓰레이터가 있는 유체 제트 바늘을 뉴로마스트의 바깥쪽 가장자리에서 100μm 떨어진 곳에 배치합니다(그림 3A2).
      참고: 측면 각도 보기(그림 2C1-C2)보다는 명확한 하향식 보기(그림 2B2'-B2' 및 그림 3A3)를 제공하는 뉴로마스트를 선택하십시오.). 명확한 하향식 보기를 통해 단일 광학 평면에서 모든 정점 모발 다발을 동시에 이미징하거나 더 적은 수의 광학 평면에서 시냅스 영역을 이미징할 수 있습니다(그림 3A3).
   2. 정점 모발 다발(kinocilia)의 끝까지 초점을 맞춥니다(그림 1A, 그림 3A2 및 3A3). 유체 제트 바늘의 바닥은 이 평면에서 초점이 맞춰져야 합니다.
5. 고속 압력 cl을 설정amp 이미징 소프트웨어로부터 입력을 수신하기 위해 수동 모드에서 외부 모드로 이동합니다.
   1. "zero" 버튼을 눌러 고속 압력 클램프를 제로화합니다. 설정점 노브를 사용하여 휴식 압력을 약간 양수(~2mmHg)로 설정합니다. 고속 압력 cl의 휴식 출력을 확인하십시오.amp 헤드에 부착된 평방 인치당 파운드(PSI) 압력계를 사용합니다.tage 출력.
      알림: 시간이 지남에 따라 유체가 유체 제트 바늘로 점진적으로 흡수되는 것을 방지하기 위해 휴식 시 약간 양압을 설정하십시오. 유체가 유체 제트에 연결된 튜브로 들어가 헤드 스테이지에 도달하면 장비가 손상될 수 있습니다.
   2. 모발 다발을 자극하는 데 필요한 압력을 결정합니다. 0.125-0.25ms 동안 0.25 및 12.5V 입력(200 및 500mmHg)을 사용하여 테스트 자극을 적용합니다(그림 3A3-A3'').
      알림: 고속 압력 clamp 전압 입력(고속 압력 cl의 BNC(Bayonet Neill-Concelman) 포트에 연결되는 소프트웨어 또는 기타 장치로부터amp 명령 포트)헤드에서 배출되는 압력으로 tage, 궁극적으로 유체 제트 바늘(1.0V = 50mmHg, -1.0V = -50mmHg)입니다. 이 구성(4.2단계 참조)에서 양압(밀기)은 모발 다발을 앞쪽으로 편향시키고 음압(당김)은 모발 다발을 뒤쪽으로 편향시킵니다.
   3. 스케일 바와 함께 투과광 및 DIC 광학 장치를 사용하여 모발 끝인 키노섬모의 6.25 및 12.5mmHg 자극에 의한 편향 거리를 측정합니다(그림 2A 및 그림 3A3-3''). 번들을 약 5μm 거리(1개의 응집력 단위)로 이동시키는 압력을 선택합니다(그림 3A3''). 키노실리아의 끝이 항상 초점을 유지하는지 확인하십시오.
   4. 유충의 AP 축을 따라 유체 제트 ± 25μm를 이동하여 kinocilia 5μm의 끝을 편향시키는 거리와 압력을 찾습니다.
      참고: 수정 후 3-7일(dpf)에 유충에서 GCaMP6를 사용하면 5μm 편향이 거의 포화된 GCaMP6s 칼슘 신호를 달성해야 하며 정점 모발 다발 구조를 손상시키지 않아야 합니다(그림 3A3''). 더 작은 변위 거리를 사용하여 비포화 자극을 전달할 수 있습니다(그림 3A3'). 변위 거리>10μm는 추정하기 어렵고(그림 3A3''') 시간이 지남에 따라 손상될 수 있습니다. 신호 포화도는 신경비맘의 나이(및 운동섬모 높이)와 사용된 지표에 따라 다릅니다. 이미징 중에 각 방향(압력/밀기 및 진공/당김)에서 유체 제트 바늘의 개통성을 주기적으로 확인하십시오. 유체 제트 바늘은 쉽게 막히고 진공 개통성을 잃지만 잔류 압력 개통성은 유지됩니다. DIC 광학 장치와 각 방향의 짧은 테스트 자극을 사용하여 유체 제트 개통성을 확인합니다.
   5. 샘플을 관심 평면(예: 정점 모발 다발의 기저부 또는 시냅스면의 유모 세포 기저부; 그림 2B1-B2').
6. 이미징 획득 절차: 단일 평면 획득

참고: 이 프로토콜에 설명된 모든 이미징은 실온(RT)에서 수행됩니다.

1. 10Hz의 프레임 속도를 달성하기 위해 100ms마다 캡처하여 스트리밍 또는 연속 80프레임 수집을 수집하도록 이미징 소프트웨어를 설정합니다.
2. 게인, 조리개 및 레이저 출력을 설정하여 신호 감지를 최적화하되 채도, 광표백 및 노이즈는 피하십시오. Opterra/SFC의 예시 설정은 다음과 같습니다: 488nm 레이저 출력: 50(모발 다발 MET 평면), 75(시냅스 평면); 35μm 슬릿; 이득 = 2.7; EM 게인 = 3900.
   참고: 신호가 너무 약하거나 노이즈가 많거나 광표백이 과도한 경우 2 X 비닝을 적용합니다. 2 X 비닝은 공간 분해능을 희생하면서 신호 감지를 향상시킵니다.
3. 프레임 30 이후, 3 s.
   에서 80 프레임 (8 s) 획득 동안 전달할 자극을 선택한다. 참고: 몇 가지 예시 자극은 다음과 같다: 200 ms (+ 또는 - 0.25 V) 최대 2 s (+ 또는 - 0.25 V) 단계, 각 유모 세포의 방향 민감도를 식별하기 위해 전방 또는 후방 방향으로 2 s (+ 또는 - 0.25 V) 단계; 2 초, 5Hz 구형파(200ms의 경우 0.25V, 200ms의 경우 -0.25V, 5회 반복)로 모든 유모 세포를 동시에 자극합니다. 양압(전방 자극)은 유모 세포의 절반을 활성화합니다. 음압(후방 자극)은 유모 세포의 나머지 절반을 활성화합니다. 자극 소프트웨어 또는 장치가 압력 cl을 되돌려야 합니다.amp 자극이 끝난 후 0V로 되돌립니다.
4. 기계에 민감한 칼슘 반응을 측정합니다. 정점 모발 다발의 기저부에 초점을 맞추고(그림 2A 및 2B1-B1') 이미지 획득을 시작합니다.
   참고: 뉴로마스트를 위에서 아래로 명확하게 보면(그림 2B1-B1'), 모든 정점 모발 다발을 단일 평면에서 동시에 이미지화할 수 있습니다.
5. 시냅스 전 칼슘 반응을 측정합니다. 유모 세포의 기저부에 초점을 맞추고(그림 2A 및 2B2-B2') 이미지 획득을 시작합니다.
   참고: 뉴로마스트를 위에서 아래로 명확하게 보면(그림 2B2-B2'), 모든 유모 세포의 시냅스 전 이미징 평면은 2μm 간격으로 설정된 2-3개의 평면에서 획득할 수 있습니다. Tg[myo6b:ribeye-mcherry] 형질전환 물고기는 시냅스 전 리본과 칼슘 진입 부위를 식별하고 찾는 데 사용할 수 있습니다.

결과

그림 1: 이미징 챔버, 제브라피쉬 장착 및 심장 주사 절차, 바늘. (A) 표시된 것은 실리콘 봉지재 상단의 중앙에 고정된 유충(점선 직사각형으로 윤곽선으로 표시됨)이 있는 이미징 챔버입니다. (나1) 두 개의 핀으로 고정된 5dpf 유충이 표시됩니다. 큰 헤드 핀은 눈 바로 뒤쪽에 몸체에 수직으로 배치됩니다. 두 눈이 완전히 겹쳐져 있어 아래쪽 눈이 위쪽 눈에 의해 완전히 가려집니다. 작은 꼬리 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
α-Bungarotoxin	R&D Systems	2133	이미징 전에 유충을 마비시키기 위해
챔버	유충을 장착하기 위한	Siskiyou	PC-R
. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm	VWR	48366-227	이미징 챔버 밀봉 고
진공 실리콘 그리스	Fischer Scientific	14-635-5D	이미징 챔버에 커버슬립 부착용
실리콘 봉지재 투명 0.5g 키트	Ellsworth 접착제 Dow	Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG	이미징 챔버를 채우고 물고기를 고정할 표면을 만들기 위해 실
체 현미경	Carl Zeiss 현미경	투과광 조명이 있는 Stemi 2000	을 만들기 위해 와이어, 겸자 및 가위를 조명하는 데 미
세 집게	Fine Science Tools	Dumont #5(0.05 x 0.02mm) 품목 번호 11295-10	핀 만들기용
Fine 가위	Cole-Palmer	5.5", EW-10818-00	핀을 만들기 위해 tunsgten 와이어 절단용 텅
스텐 와이어, 0.035mm	Goodfellow	W005131	유충을 고정시키는 헤드 핀용
텅스텐 와이어, 0.025mm	ThermoFischer Scientific	AA10405-H4	유충을 고정시키는 꼬리 핀용
라멘트가 없는 붕규산 유리 모세관	Sutter Instrument Company	B 150-86-10	유모 세포를 자극하기 위해 유체 제트 바늘로 당겨질 유리
미세 집게 Fine	Science Tools	Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) 품목 번호 11295-10	유충 고정용
젤 로딩 팁	Eppendorf	5242956003	심장 주사 바늘 되메우기용
체현미경	Carl Zeiss 현미경	Stemi 2000 투과광 조명 고정	및 심장 주입 중 유충 조명용
모세관/바늘 홀더	WPI	MPH315	유체 제트 바늘 고정용
수동 미세 매니퓰레이터	Narishige	M-152	α-방가로톡신 주입을 위한 바늘 홀더의 고정 및 위치 지정용
마그네틱 스탠드	Narishige	GJ-1	α-방가로톡신 주입용 수동 마이크로매니퓰레이터 고정용
인젝터	Eppendorf	Femtojet 4x	α-방가로톡신 전달
공초점 현미경	Bruker	Swept field/Opterra 공초점 현미경	DIC 광학 및 적절한 필터가 있는 488nm 레이저가 있는 고정형 정립 현미경
현미경 소프트웨어	Bruker	Prairieview 5.3	현미경, 레이저, 스테이지, piezo-z, 카메라 및 유체 제트
10x 공기 대물렌즈	Nikon	MRH00101	유충 및 유체 제트 위치 지정을 위한 저배율
60x 물 대물렌즈	Nikon	MRF07620	높은 NA(1.0) 및 적절한 작동 거리(2.0mm)를 갖춘 물 침수 대물렌즈컨트롤러
/드라이버가 있는 Piezo-Z 대물렌즈 스캐너	Physik Intruments 기기/Bruker	01144210/UM-Z-PZ	0.025um 정확도의 고속 Z-스택 획득
EMCCD 카메라	QImaging	Rolera EM-C2 EMCCD 카메라	초당 최대 100프레임을 획득할 수 있는 작은 픽셀 크기의 카메라
원형 챔버 어댑터	Siskiyou	PC-A	현미경 스테이지에서 이미징 챔버를 고정하고 회전시키는 데 전
동 Z-데크 스테이지	Prior Scientific	ZDN12MP	체 제트 바늘로 샘플과 마이크로 매니퓰레이터를 함께 고정하고 이동할 수 있는 현미경 스테이지
Z-데크 스테이지 인서트 어댑터 NIH	기계 공장	사용자 정의	형 챔버 어댑터를 z-데크 스테이지에 맞추기 위해
유체 제트 장치	ALA 과학 기기	HSPC-1 PV-PUMP가 있는 고속 압력 클램프	유체 제트 자극 제어 및 전달용
Masterflex 과산화물 경화 실리콘 튜브(1피트)	Cole-Palmer	Masterflex L/S 13, 96400-13	유체 제트 니들 홀더를 압력 펌프에 연결하기 위해
동 마이크로 매니퓰레이터	Sutter Instrument Company	MP-225	유체용 니들 홀더의 고정 및 위치 지정용 제트
마이크로매니퓰레이터 컨트롤러	Sutter Instrument Company	MPC-200	유체 제트 니들 매니퓰레이터 제어용
로딩 팁	Eppendorf	5242956003	체 제트 바늘 백필용
모세관/바늘 홀더	WPI	MPH315	유체 제트 바늘 고정 PSI
압력계	Sper Scientific	840081	측정용 압력 클램프 출력
Prism7	그래프패드	Prism7	GCaMP6 강도 변화를
FIJI	Schindelin, et., al.34	https://fiji.sc/	이미지를 처리하고 시공간 신호 맵을 생성하는 소프트웨어
Turboreg 플러그인	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/	FIJI에 GCaMP6 이미지 시퀀스를 등록하는 플러그인
StackReg 플러그인	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ FIJI Times Series Analyzer V3 플러그인에 GCaMP6 이미지 시퀀스를 등록하는 플러그인 Balaji J 2007, UCLA의 신경생물학과
		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html	GCaMP6 강도 변화를 측정하기 위해 여러 ROI를 생성하는 플러그인

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