primers와 열린 독서 프레임 1 (ORF1) ORF2 접합 영역입니다 노로 바이러스의 게놈 중 가장 보존 지역에 대한 구체적인 TaqMan 프로브를 이용하여 아이들의 stools에서 탐지 및 노로 바이러스의 분리의 genogroup 식별을위한 원 - 스텝 RT-PCR 분석 설명했다. 비상업적인 비용 효율적인 RNA 추출 방법을 자세히 설명하고 있습니다.
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방법 논문
Taqman함으로써 어린이 Stools에서 Noroviruses의 감지 및 Genogrouping 한 단계 RT-PCR
이 논문에서
요약
초록
Noroviruses (NoVs)는 모든 연령층의 사람에있어서 세계적으로 산발적 급성 위장염의 발생의 주요 원인입니다. 그들은 Rotavirus의 그것과 유사한 공중 보건에 미치는 영향과 아동 입원의 중요한 원인입니다. NoVs 좋은 유전자 다양성의 RNA 바이러스이며 새로운 변종의 지속적인 모습이 있습니다. 다섯 genogroups 인식되며, GI과 GII들의 많은 genotypes과 인간의 감염에 대한 가장 중요한되고 subtypes와 함께. 그러나,이 두 genotypes의 진단은 진단과 치료를 지연, 문제가 남아 있습니다. 1, 2, 3
대변 표본에서 RNA 추출에 가장 일반적으로 사용되는 방법은 Qiagen에서 QIAmp 바이러스성 RNA 상용 키트입니다. 이 메서드는 버퍼, 실리카 겔 막의 바인딩 속성을 결합하여 그 제어 RNases 및 microspin의 속도와 함께 컬럼으로 RNA의 최적의 바인딩을 제공합니다. 이 방법은 간단하고 빠르고 신뢰성이 있으며 카입니다제조 업체에서 제공한 설명에 자세히되는 몇 가지 단계에 뻔했어.
노로 바이러스는 설사의 가장 흔한 원인으로서 rotavirus에게만 초입니다. 노로 바이러스 진단은 설사의 pathogenesis에 대한 모든 연구에서뿐 아니라 발병이나 개별 설사 케이스에서 사용할 수 있어야합니다. 현재는 그러나 노로 바이러스 진단은 진단 간단한 방법의 부족으로 인해 단 몇 센터로 제한됩니다. 이 지연 진단 및 치료 1, 2, 3. 또한, 국가 사이와 사이의 비용과 부식성 버퍼의 규제로 인해 교통이 병참 문제를 포즈 이러한 제조 키트를 사용하십시오. 따라서이 프로토콜에 우리는 원래 붐을 기반으로 대안, 경제, 사내 방법을 설명 외 guanidinium thiocyanate의 안티 nuclease 특성과 함께 실리카 입자의 핵산 바인딩 속성을 사용합니다. 방법 4 .
외 의해 설명되어 primers를 사용 5.의 주요 단백질에서 높은 변수 N-터미널 - 껍질을 대상으로 기존의 RT-PCR의 경우 상세하게됩니다. 종래의 PCR에서 PCR 제품의 시퀀싱하면 GI과 GII의 genogroups에 속하는 genotypes의 차별을 가능하게합니다.
프로토콜
1. 대변 샘플
- 대변 샘플은 RNA를 유지하기 위해 냉동 보관해야합니다. 10 % 배설물 현탁액을 하시려면 해동 대변 샘플의 약 0.1 g을 가지고 PBS 1 개 ML을 완료합니다.
- 피할 200 μl의 나누어지는은 동결 융해 반복했다. -70 ° C.에 aliquots를 저장
- 영유권 및 추출에 사용하기 전에 10 분 동안 4천그램에서 aliquots을 원심 분리기.
2. 구아니딘 및 실리카로 추출을위한 실리카 입자의 작성
- RT에서는 이산화 규소 30 G를 중지하고 최대 250 ML에 DH 2 O와 완료합니다.
- 침전의 24 시간 후에 흡입에 의해 뜨는의 215 ML을 제거합니다. 최대 250 ML에 DH 2 O를 추가하고 흔들림으로 실리카 펠렛을 일시 중지합니다.
- 또 24 시간 후에 흡입에 의해 뜨는을 제거하고 pH를 2.0으로 실리카 현탁액의 산도를 조정, 염산 (HCL)을 사용합니다. 유리 봇에서 나누어지는 실리카 현탁액을tles 및 압력솥.
3. 구아니딘 및 실리카로 추출을위한 L6 버퍼의 작성
- <....
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토론
대변 샘플로부터 핵산을 분리해위한 방법을 사내에 경제를 사용하여, 우리는 Qiagen의 상업 QIAmp 바이러스성 RNA 키트와 마찬가지로 동일한 결과를 얻을, 함께 TaqMan RT-PCR 저희 연구실에서 개발된들과 우리 월 광범를 감지할 수 있습니다 GI과 GII genogroup에 속하는 genotypes. 지역 C 프로토콜의 최근 출간은 78 % 6의 genotyping 속도를 보도했다. 현대 월의 종자의 다양성 이전 년 동안 증가되어 있기 때문에 성공률 테스트중인 표본에 대한 지역 C의 primers의 불일치에 따라 달라집니다. 그것 때문에 시간이 7 주위의 회전을 단축, 사후 증폭 제품 처리를 제거로서 분석은 일상적인 진단하는 데 유용합니다. 외에도 진단에서이 프로토콜은 또한 따라서이 질환의 공중 보건 관리에 유용되고, 월 감염의 역학을 명확히 사용할 수 있습니다.
검사를 실행하면 RT-PCR, 프라이머 / 프로브 집합에 .......
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공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
저자는 월위한 표준 및 제어 반응의 종류 선물 질병 통제 예방을위한 국립 Calicivirus 연구실 센터 (CDC)에 감사 드리고, 그리고 시약을 제공 존스 홉킨스에서 공중 보건 학부의 실험실 것이다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| 구아니딘의 isothiocyanate | 시그마 - Adrich | G9277 | |
| 트리스 HCL | 시그마 - 올드 리치 | T5941 | |
| EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | 시그마 - 올드 리치 | E5134 | |
| 규토 | 시그마 - 올드 리치 | S5631 | |
| 트리톤 X 100 | BDH 화학 | 14,530 | |
| Diethylpyrocarbonate | 시그마 - 올드 리치 | D-5758 | |
| 바이러스성 RNA 미니 키트 (250) QIAamp | QIAGEN | 52,906 | |
| QuantiTEC 프로브 RT-PCR 키트 (200) | QIAGEN | 204,443 | |
| Qiagen 한 단계 RT-PCR 키트 (200) | QIAGEN | 210,212 | |
| Rnase 억제제 2,000 단위 | A.Biosystems | N808-0119 | 2000 unids / 유리병 |
| 비 스틱 Rnae 프리 Microfuge 튜브 | Ambion | AM12450 | |
| UltraPure 아가로 오스 1,000 | Invitrogen | 16550-100 |
참고문헌
- Medici, M. Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy. L. Medical Virology. 78, (2006).
- Vidal, R. Novel recombin....
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재인쇄 및 허가
