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동물 샘플과 관련된 모든 절차는 적절한 동물 윤리 검토 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다.
1. 준비
1. 두 개의 미세한 톱니 모양 겸자를 사용하여 약 1mm 너비의 작은 섬유 다발로 각 근육을 놀립니다.
참고: 놀리는 동안 조직 손상을 방지하려면 집게로 과도한 힘을 가하지 않고 매우 부드럽게 근육을 조작하는 것이 중요합니다.
1. 전경골근(TA) 근육의 크기에 따라 3개 또는 4개의 묶음으로 분리합니다.
2. 비복근(GA)의 경우 근육의 내측 부분과 외측 부분을 분리한 다음 크기에 따라 각 부분을 4-5개의 묶음으로 분리합니다.
2. 면역염색
1. 근섬유 투과화 진행: 근육 다발을 인산염 완충 식염수(PBS)에 1%(v/v) Triton X-100을 함유한 24웰 플레이트로 옮기고 RT에서 1시간 또는 4°C에서 5시간 동안 부드럽게 교반(50rpm)합니다.
참고: 별도의 면역염색을 진행하고 항체 혼란의 위험을 최소화하기 위해 두 플레이트 사이에 근육 다발을 분할합니다. 두 개 이상의 웰(1웰/플레이트)으로 분할하지 마십시오. 그렇지 않으면 분석된 근육에서 일반적인 상태를 대표하는 신경근 접합부(NMJ)의 수(N)가 충분하지 않을 수 있습니다.
2. 샘플을 RT에서 PBS로 5분 동안 3회 세척하고 PBS/Triton X-100 1%에서 4% 소 혈청 알부민(BSA)으로 구성된 차단 용액과 함께 4°C에서 4시간 동안 부드럽게 교반(50rpm)합니다.
참고: 세척 단계 중에 흡인 펌프를 사용하지 말고 200μL 피펫과 작은 크기의 팁을 사용하여 용액을 수동으로 흡인하십시오(참조는 재료 표에 표시됨).
3. 뉴로필라멘트 M(NF-M, 2H3, 희석 1/200) 또는 시냅스 소포 당단백질 2(SV2, 희석 1/200)에 대한 1차 단클론 항체를 포함하는 2.2단계에 표시된 차단 용액과 함께 4°C에서 하룻밤(O/N)을 배양하여 각각 시냅스 전 축삭 말단 또는 활성 영역을 표지합니다.
4. 다음날 교반(50rpm)하면서 PBS에서 근육 다발을 5분 동안 3회 세척합니다.
1. 공초점 이미징의 경우: 적색 발광 형광단(F594)(희석 1/500) 및 녹색 발광 형광단(α-BTX-F488)(희석 1/1000)과 접합된 α-방가로톡신과 접합된 2차 항마우스 항체와 근육 다발을 교반(50rpm) 하에 RT에서 2시간 동안 PBS에 배양합니다.
2. 자극 방출 고갈(STED) 이미징의 경우: 녹색 방출 형광단(F488)(희석 1/500) 및 높은 광안정성(α-BTX-F633)(희석 1/1000)을 특징으로 하는 원적외선 형광단과 접합된 α-방가로톡신과 접합된 2차 항마우스 항체와 근육 다발을 교반(50rpm) 하에서 RT에서 2시간 동안 배양합니다.
참고: 광표백을 피하기 위해 배양하는 동안 샘플을 빛에 노출시키지 마십시오.
5. 교반(50rpm) 하에서 PBS로 라벨이 붙은 근육 다발을 5분 동안 3회 세척하고 마운팅 매체가 있는 슬라이드 위에 놓습니다.
참고: 밀봉을 허용하기 위해 슬라이드당 최대 4-5개의 근육 다발을 배치합니다.
6. 상단에 등급 #1.5(또는 #1.5H) 유리 커버슬립(두께 0.17mm)을 추가하고 슬라이드 양쪽에 원통형 자석을 배치하여 압력을 가하고 근육을 평평하게 만듭니다.
7. 슬라이드를 4°C에서 가벼운 O/N으로부터 보호하십시오. 매니큐어로 슬라이드를 영구적으로 밀봉하십시오.
3. 이미지 획득
1. 공초점 현미경에 의한 획득
참고: 이미지는 63배 등급의 오일 침지 대물렌즈(HCX Plan Apo CS, 1.4 개구수(NA))를 사용하여 도립 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 수집되었습니다.
1. 맹검 분석의 경우 분석에 관여하지 않은 사람이 주어진 번호로 각 슬라이드를 코딩하도록 합니다. 모든 샘플에 대해 NMJ 매개변수의 정량화가 완료될 때까지 실험 그룹에 대해 눈이 멀게 유지하십시오.
2. >machine.xlhw> 구성 모드에서 현미경 소프트웨어를 시작합니다.
3. 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 DAPI 필터 세트로 DAPI 광시야 형광 조명 아래를 보아 샘플 내의 관찰면을 찾습니다.
4.프로젝트 열기 > 새 프로젝트를> 클릭하고 이미지 획득을 저장할 폴더를 만듭니다.
참고: 폴더 크기를 제한하고 컴퓨터 메모리 문제를 방지하기 위해 각 NMJ에 대해 새 프로젝트를 만듭니다.
5. 획득 매개변수를 관리하려면 획득 탭 창을 클릭하고 컨포칼 핀홀을 1.0 Airy 단위로 설정하고 레이저 출력을 설정하여 이미징해야 하는 엔드 플레이트에서 488nm 레이저를 사용하여 녹색/F488(α-BTX) 형광에 대한 게인 및 오프셋 레벨을 최적화합니다(라이브 모드 켜짐).
6. 다음으로 F594 관찰에 적합한 레이저를 사용하여 적색/F594(NF-M 또는 SV2) 형광 획득을 최적화합니다. 본 연구에서는 552nm 레이저를 사용하였다(라이브 모드 ON). 각 레이저에 대해 414-483nm의 레이저 405(DAPI), 506-531nm의 레이저 488(F488-α-BTX), 622-650nm의 레이저 552(NFM/SV2) 범위로 염료 방출 스펙트럼을 설정합니다.
7. 동일한 설정으로 각 실험 그룹에서 신경근 접합부의 이미지 스택을 수집합니다: 이미지 크기 1024 x 1024 픽셀(73.7 x 73.7 μm) 400Hz 샘플링 속도, 양방향 X ON, 줌 계수 2.5, Z-스텝 크기 0.5 μm(Z-Wide 모드).
참고: 각 NMJ에 대해 전체 접합을 획득하도록 슬라이스 수가 설정됩니다. 위에서 설명한 획득 설정은 Nyquist-Shanon 샘플링 정리를 충족합니다. 그러나 사용자는 최근의 모든 공초점 운영 소프트웨어에 있는 형식 최적화 버튼을 클릭하여 픽셀 크기와 Z-스텝이 이상적인 나이퀴스트 샘플링 속도를 충족하는지 확인할 수 있습니다. 이 작업을 수행하면 이미지가 과도하게 샘플링되거나 과소 샘플링되어 볼륨 측정의 정확도가 손실되는 것을 방지할 수 있습니다.
8. 원본 파일(.lif) 또는 Z-스택 이미지(.tif)를 슬라이드의 코드명, 염색 유형 및 엔드플레이트 번호가 포함된 이름의 폴더에 저장합니다.
참고: F488 형광이 F594 채널로 또는 그 반대로 누화되는 것을 방지하기 위해 488nm 및 552nm 레이저(F488 및 F594)를 사용하여 스캔을 순차적으로(동시가 아님) 수집합니다(블리드스루). 빔 경로는 현미경 소프트웨어의 Dye Assistant로 구성할 수 있습니다.
9. 다음 코딩된 슬라이드로 변경하고 각 NMJ에 대해 3.1.3-3.1.8단계를 반복합니다.
10. 세션이 끝나면 3D 뷰어에서 열기를 클릭하고 3D 라벨링을 시각화할 실험 그룹의 NMJ 대표를 선택합니다.
참고: 이 보기 모드는 획득 매개변수가 올바른지 확인하는 데 도움이 됩니다.
11. 현미경 소프트웨어를 닫고 렌즈 티슈로 대물렌즈를 청소한 다음 시스템을 끕니다.
2. STED 현미경
참고: 이미지는 100x 오일 침지 대물렌즈(HC PL APO CS2 1.4 NA)를 사용하여 775nm에서 Gated STED가 장착된 도립 레이저 주사 공초점 현미경으로 수집되었습니다.
1. 맹검 분석의 경우 분석에 관여하지 않은 사람이 주어진 번호로 각 슬라이드를 코딩하도록 합니다. 모든 샘플에 대해 NMJ 매개변수의 정량화가 완료될 때까지 실험 그룹에 대해 눈이 멀게 유지하십시오.
2. machine.xlhw 및 STED ON> 구성 모드에서 현미경 소프트웨어를 시작합니다.
3. 프로젝트 열기 > 새 프로젝트를 클릭하여 이미지 획득을 저장할 폴더를 만듭니다.
>참고: 폴더 크기를 제한하고 컴퓨터 메모리 문제를 방지하기 위해 각 슬라이드에 대해 새 폴더를 생성합니다.
4. 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 488nm 레이저를 사용하여 광시야 형광 조명 하에서 관찰하여 샘플 내의 관찰면을 찾습니다.
5. 506-531nm의 스펙트럼 검출과 함께 488nm 레이저를 사용하여 뉴로필라멘트 M(NFM) 또는 SV2 염색으로 표지된 NMJ를 검색합니다.
6. NMJ가 식별되면 STED 활성화를 클릭하고 635-640nm의 스펙트럼 감지와 함께 750nm 레이저를 사용하여 여러 접합 주름이 포함된 영역에서 이미지 획득을 시작합니다.
>참고: 이미지 획득 중 채도 조회 테이블에 주의하고 과다 노출을 방지하기 위해 빠른 LUT 버튼을 클릭하십시오(회색 값 >255, 8비트의 경우).
7. 동일한 설정으로 각 실험 그룹의 이미지를 수집합니다: 이미지 크기 2048Hz 샘플링 속도에서 38.75 x 38.75 픽셀(400 x 400 μm).
참고: 공핍 레이저(STED) 출력은 65%로 설정되어 있습니다.
8. 슬라이드 코드가 포함된 파일 이름으로 이미지를 저장합니다.
참고: 최적화된 XY 형식: 형식 설정을 클릭하여 STED 이미징으로 최상의 획득 설정을 얻을 수 있습니다.
9. 다음 코딩된 슬라이드로 변경하고 3.2.3-3.2.8단계를 반복합니다. 모든 슬라이드에 대해 이 절차를 반복합니다.
10. STED 현미경 세션이 끝나면 이미지 파일을 다른 컴퓨터로 전송하고 원본 파일(.lif)을 외부 드라이브 또는 서버에 저장합니다.
11. 현미경 소프트웨어를 끄고 렌즈 조직으로 대물렌즈를 청소한 다음 시스템을 끕니다.