동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 수조 마그나 캐뉼라, 헤드 플레이트 및 헤드 홀더 준비
- 수술 전에 모든 수술 기구와 헤드 플레이트를 소독하십시오.
참고: 형광 추적자는 수조 마그나 캐뉼라 삽입을 통해 CSF로 직접 전달됩니다. - 간단히 바늘 드라이버를 사용하여 30G x 12.7mm(1/2인치) 바늘의 끝을 3/4 아래로 부러뜨리고 바늘의 뭉툭한 끝을 폴리에틸렌 10(PE10) 튜브(약 45cm 길이)의 한쪽 끝에 놓습니다. 베벨만 PE10 튜브의 경계 밖으로 돌출되어 있는지 확인하십시오.
- 다른 30G 바늘의 경사진 끝의 1/4을 부러뜨리고 플라스틱 루어 잠금 장치가 부착된 상태에서 나머지 바늘의 무딘 끝을 PE10 튜브의 다른 쪽 끝에 놓습니다.
- 100μL 유리 주사기에 멸균 인공 CSF(aCSF: 126mM NaCl, 2.5mM KCl, 1.25mM NaH2PO4, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM 포도당 및 26 mM NaHCO3)를 채웁니다.
- 주사기를 라인 끝에 부착하고 경사진 바늘 끝에 도달할 때까지 aCSF로 채웁니다. 공기 기둥은 다양한 주입량에 더 취약하기 때문에 주사기가 공기가 아닌 aCSF로 다시 채워지는 것이 중요합니다.
- 만성 실험의 경우 aCSF로 채워진 라인을 그대로 두고 1.7단계를 건너뜁니다.
- 급성 실험의 경우 주사기를 주입 펌프에 놓고 약 5mm의 공기를 빼내면 혼합을 방지할 수 있습니다. 그런 다음 실험에 필요한 추적자의 총 부피를 인출합니다(데드 스페이스 손실로 인해 20% 추가 권장).
참고: PE10 튜브는 추적자를 적재할 때 기포가 유리 주사기의 플라스틱 커프에 들어가지 않도록 충분히 길어야 합니다. 일반적인 실험의 경우, 프로토콜은 aCSF에서 0.5%로 희석된 Alexa Fluor 647(BSA-647)에 접합된 소 혈청 알부민 10μL를 사용합니다. - 헤드 플레이트가 헤드 홀더에 맞는지, 사용 중인 마우스에 적합한 크기인지 확인합니다. 이를 보장하기 위한 해부학적 마커는 다음과 같습니다: 창의 상단 경계는 안구 간 선과 정렬되고 후방 경계는 후두능선에 주둥이로 떨어집니다.
참고: 스테인리스 스틸 헤드 플레이트는 멸균하여 재사용할 수 있습니다. 대부분의 시아노아크릴레이트 혼합물은 아세톤 용액으로 제거할 수 있습니다.
2. 수술 절차
- 마우스의 무게를 측정하고 마취합니다(예: 케타민/자일라진; 100mg/kg 케타민, 10mg/kg 자일라진; i.p.).
- 마우스가 더 이상 발가락 꼬집음에 반응하지 않으면 멸균수로 목과 머리를 적시고 가위를 사용하여 면도하십시오. 해당 부위를 면도한 후 알코올 면봉으로 해당 부위를 다시 닦아 잔여 머리카락을 제거합니다.
참고: 클리핑하기 전에 털을 적시면 절개 후 이미징 창의 머리카락의 양이 크게 줄어듭니다. - 온도 조절 패드 위에 있는 정위 프레임에 마우스를 놓고 마우스의 눈에 석유 안용 연고를 발라 건조하지 않도록 합니다.
- 클로르헥시딘 면봉으로 노출된 피부를 청소하십시오. 2분 후 알코올 물티슈로 클로르헥시딘을 제거합니다. 마지막으로 말릴 수 있는 요오드 용액을 바릅니다.
피- 하 진통제(0.25% 부피바카인 HCl)를 두개골 상단과 목에 주사합니다.
- 후두능선을 덮고 있는 목 부분부터 시작하여 위에 있는 피부에 정중선을 자르고 안와간 선을 향해 주둥이쪽으로 계속합니다. 측두근이 두개골에 삽입되는 경계를 옆으로 절개합니다. 방추형 절개의 모든 피부를 제거하여 전두골과 정수리뼈를 모두 노출시킵니다.
주의: 안와후부비동은 눈의 꼬리쪽에 있고 안면 후방정맥의 큰 가지는 귓바퀴의 주둥이에 있습니다. 이러한 구조를 보존하기 위해 절개를 할 때 주의하십시오. 이런 일이 발생하면 멸균 면봉으로 몇 분 동안 지혈을 유지하여 출혈을 멈추고 계속하십시오. - 멸균 식염수로 두개골을 세척하고 면봉을 사용하여 표면을 청소하여 이미지 품질을 방해하므로 부스러기와 머리카락이 없도록 합니다. 두개골 투명도는 골막과 그 위에 있는 근막을 그대로 두면 가장 잘 보존됩니다.
참고: 이러한 구조를 실수로 제거하면 시간이 지남에 따라 두개골이 건조해지고 불투명해질 수 있습니다. aCSF로 다시 적시거나 파라핀 오일과 글리세롤의 혼합물을 사용하여 급성 실험에서 두개골 반사율을 줄입니다. - 수조 마그나 캐뉼라 삽입을 진행합니다.
- CM 캐뉼라를 삽입한 후 치과용 시멘트와 시아노아크릴레이트 접착제의 혼합물을 경계 주위의 헤드 플레이트의 복부 쪽에 도포하고 두개골에 배치하여 헤드 플레이트의 앞쪽 경계가 코뼈의 뒤쪽 끝과 정렬되고 후방 경계가 두정엽 뼈의 앞쪽과 정렬되도록 합니다. 시상 봉합사(정중선)가 창을 기준으로 중앙에 있고 직선인지 확인합니다(그림 1B).
- 접착제 가속기 몇 방울을 사용하여 헤드 플레이트의 위치를 고정합니다. 시멘트 혼합물로 남은 틈을 채우고 촉진제로 경화합니다.
주의: 시아노아크릴레이트가 마우스의 눈에 닿거나 이미징 창을 막지 않도록 하십시오. - CM 캐뉼라를 헤드 플레이트에 붙여 운송 중이나 마우스가 깨어날 때
분리되지 않도록 합니다.- 급성 실험의 경우 2.16단계로 건너뜁니다.
- 만성 실험의 경우 노출된 두개골에 투명하게 건조된 시아노아크릴레이트 접착제를 얇게 바르고 기포가 생기면 이미징을 방해할 수 있으므로 주의하십시오. 접착제는 두개골을 보호하며 이미징을 방해하지 않습니다. 접착제가 노출된 두개골을 절개 경계의 피부까지 덮고 있는지 확인하십시오.
- 지혈 클램프를 사용하여 aCSF로 채워진 PE10 튜브를 CM에서 2-3cm 떨어진 곳에 고정하고 고온 소작 팁으로 라인을 절단합니다. 분리되면 녹은 PE10 튜브를 평평하게 펴서 캐뉼라를 밀봉합니다.
주의: 캐뉼라를 밀봉하고 CSF 누공을 방지하기 위해 캐뉼라를 밀봉하고 튜브에 누출이 없는지 확인할 때까지 cl을 놓지 마십시오. - 카프로펜(3일 동안 24시간마다 5mg/kg, 복강내[i.p.] 또는 피하[s.c.])을 투여하고 마우스를 온도 조절이 가능한 단일 주택 케이지로 되돌리고 이미징 전 최소 24시간 동안 회복되도록 합니다. 쥐가 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복할 때까지 마우스를 방치하지 마십시오. 온전한 두개골 창은 몇 주 동안 안정적으로 유지됩니다. 참고: 만성 실험은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
주의: 일부 수술 후 합병증은 두부혈종/갈기하 혈종, CSF 누공 및 감염입니다. - 급성 실험의 경우 두개골이 고정된 위치에 있도록 헤드 플레이트를 사용하여 마우스를 헤드 홀더에 넣습니다. 마취 수준을 확인하고 마우스 아래에 가열 패드를 놓으십시오. 이제 마우스를 거시경으로 가져갈 준비가 되었습니다.
주의: 마우스를 주입 펌프와 함께 카트에 싣고 조심스럽게 운반하십시오. CM 캐뉼라 삽입이 빠지면 두개내압이 떨어지고 CSF 누출로 인해 실험 결과가 변경됩니다.
3. 이미징을 위한 마우스 준비
참고: 프로토콜은 이미징 실험이 마취된(단계 3.1에서 시작) 또는 깨어 있는(단계 3.2에서 시작) 마우스에서 수행되는지 여부에 따라 다릅니다.
- 마취된 마우스
- 헤드 홀더를 거시경 스테이지에 놓고 주사기 펌프에서 CM 캐뉼라까지의 라인에 꼬임이 없는지, 추적자 주입에 영향을 미칠 수 있으므로 팽팽하지 않은지 확인합니다.
- 호흡수와 점막의 분홍색을 관찰하여 산소 공급이 양호함을 나타냅니다. 필요한 경우 식염수를 피하에 주입하여 수분 수준을 확보하십시오. 동물이 충분히 마취되었는지 확인하고 필요한 경우 다시 투여하십시오.
- 매크로스코프 카메라와 발광 다이오드(LED)를 켜고 LIVE 모드를 시작합니다.
- 시상 봉합사가 이미지 중앙에 평행하고 중앙에 위치하여 필드 상단의 비전두엽 봉합사와 하단의 람도이드 봉합사가 명확하게 시각화될 수 있도록 이미징 필드의 배율을 확인합니다(그림 1C). 제자리에 있으면 헤드 홀더를 테이프로 거시경 스테이지에 고정합니다.
- 노출된 두개골에 거시경의 초점을 맞춥니다. 상대적으로 큰 피사계 심도를 가진 거시경에도 불구하고 마우스 두개골의 곡률은 특정 영역에만 초점을 맞출 수 있도록 합니다. 초점면이 관상 봉합사 뒤쪽 두정골의 측면에 위치할 때 최상의 결과를 얻을 수 있습니다.
참고: 이것은 대부분의 CSF 유입이 발생하는 중대뇌 동맥(MCA)의 위치입니다(그림 1D, E).
- 깨어 있는 쥐
- 이미징 세션 전에 동물이 헤드 플레이트 수술에서 최소 24시간 동안 회복되도록 합니다. 더 긴 회복 기간(5-7일)도 권장됩니다. 이 시간 동안 회복 기간 동안 하루 0.5-1시간 동안 구속 튜브의 스테이지에 머리를 고정하도록 마우스를 훈련시킵니다.
참고: 익숙화를 통해 마우스를 마취 없이 헤드 홀더에 부착할 수 있으며 실제 실험 중 스트레스와 불안을 줄일 수 있습니다. 이것이 실현 가능하지 않고 마취가 실험을 방해하지 않는 경우, 흡입 마취제의 유도 용량(예: 1-2 L/min O2 유속에서 이소플루란 2%)을 사용하여 마우스를 헤드 스테이지에 신속하게 부착할 수 있습니다. - 마우스가 헤드 홀더와 구속 튜브에 고정되면 3.1.1-3.1.5단계를 따릅니다.
4. 형광 CSF 추적자 주입
- 급성 CM 캐뉼라 삽입
- 1.6단계에서 추적자는 수조에 배치되기 전에 이미 캐뉼라에 로드되었으므로 주입 펌프를 원하는 속도와 부피로 설정합니다. 일상적으로 사용되는 주입 패러다임은 1-2 μL/min에서 5-10 μL이지만 이러한 매개변수는 특정 실험 또는 동물의 크기 및 연령에 따라 조정할 수 있습니다.
- 만성 CM 캐뉼라 삽입
- 이미징 세션을 시작하기 전에 급성 실험의 경우 1.2-1.7단계에 따라 추적자를 전달하기 위한 주입 라인을 준비합니다.
- 라인이 준비되면 지혈제 클램프를 사용하여 만성 CM 캐뉼라의 밀봉된 끝을 절단합니다. 4.2.1단계에서 준비한 선에서 바늘을 꺼내 캐뉼라에 부드럽게 삽입합니다. 클램프를 풀고 주사기 펌프를 사용하여 추적자가 CM에 이식된 바늘에 도달할 때까지 실험을 위해 원하는 주입 속도(예: 2μL/min)로 CSF 추적자를 전진시킵니다.
주의: 라인을 연결할 때 바늘이 튜브를 관통하면 바늘을 제거하고 피어싱된 부분을 자른 다음 이 단계를 반복합니다. PE10 튜브가 찢어지면 누출이 발생하고 실험 결과에 영향을 미칩니다.
5. 이미징 세션 설정
주
- 입되는 형광 추적자를 기반으로 각 채널의 여기 파장과 노출 시간을 결정합니다. 타임랩스 이미징의 시간적 해상도를 최대화하기 위해 추적자를 시각화하는 데 필요한 최단 노출 시간을 선택하십시오. 이 노출 시간은 서로 다른 동물 간의 CSF 수송을 비교하는 것을 목표로 하는 모든 후속 실험에 사용됩니다.
참고: 한 가지 팁은 CM 라인의 추적자를 사용하여 노출 시간을 조정하는 것입니다. 이는 유용한 첫 번째 접근 방식이지만 시간이 지남에 따라 최적화되어야 합니다. - 실험 기간과 이미지를 획득할 간격을 선택합니다. 실험은 일반적으로 글림프 수송의 어느 단계에 관심이 있는지에 따라 30-60분 동안 지속됩니다. 대부분의 실험에는 1프레임/분 이상의 프레임 속도로 충분합니다.
- 파일 이름과 저장 디렉토리를 설정합니다.
- 다른 변수(예: 심전도, 동맥 혈압, 전기생리학)의 동시 획득과 함께 영상이 수집되는 경우 거시경과 펌프가 데이터 수집 소프트웨어로 트리거되도록 프로그래밍할 수 있습니다. 다음 단계로 이동하기 전에 매크로스코프의 트리거링 기능이 올바른지 확인하십시오.
6. 경두개 광학 영상 실험
- 추적자 주입과 이미징을 동시에 시작합니다.
- CM 캐뉼라와 PE10 튜브에 누출 징후가 있는지 정기적으로 점검하십시오. CM에서 추적자가 누출되는 경우 이 실험의 결과를 제외해야 합니다.
참고: 추적자가 소뇌에 축적되기 시작하고 중대뇌동맥(MCA)의 글림프 경로를 통과하지 않으면 CM 캐뉼라가 소뇌에 주입되었을 가능성이 높습니다. 이 데이터는 포함되어서는 안 됩니다. - 급성 실험의 경우 실험 완료 후 현미경에서 마우스를 제거하고 여전히 적절하게 마취되어 있는지 확인합니다. 쥐의 목을 재빨리 베고 뇌 조직을 채취하십시오. 4°C에서 밤새 4% 파라포름알데히드(PFA)에 뇌를 침지 고정합니다.
- 만성 실험의 경우 이미징이 완료되면 캐뉼라에서 CM 라인을 제거하고 멸균 aCSF로 플러시한 다음 고온 소작 팁으로 CM 캐뉼라를 다시 밀봉합니다. 헤드 스탠드에서 마우스를 제거하고 케이지로 되돌립니다. 추가 이미징이 필요하지 않을 때까지 이 프로세스를 반복한 다음 6.3단계를 따릅니다.
