3광자 형광 현미경을 사용한 제브라피쉬 뇌의 심부 조직 이미징

초록

출처: Hontani, Y., et al. 온전한 마우스와 제브라피쉬 뇌의 심부 조직 3광자 형광 현미경. J. Vis. 경험. (2022년)

이 비디오는 마취된 제브라피쉬 뇌에서 3광자 이미징의 설정 및 실행을 보여줍니다. 이 프로토콜은 형광 표지된 뉴런의 심부 조직 시각화를 가능하게 하여 신경과학 연구 응용 분야를 위한 실시간 뉴런 활동 및 구조를 밝힙니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 제브라피쉬 뇌의 생체 내 이미징
   참고: 대물 렌즈 아래에서 물고기 뇌를 올바르게 찾기 위해 광시야 이미징을 위한 여기광과 동일한 경로에 2차 전하 결합 장치(CCD) 카메라가 사용됩니다.
   
   1. 현미경을 설정하고 파워를 보정합니다.
   2. 저배율(일반적으로 4배) 대물렌즈를 현미경에 놓습니다.
   3. 생선과 튜브가 들어 있는 페트리 접시를 현미경 아래에 놓습니다.
   발
   4. 광 다이오드(LED) 광원을 사용하여 페트리 접시를 비춥니다.
   5. 이미지 획득 소프트웨어의 카메라 모드를 엽니다(그림 1).
   6. 라이브를 클릭합니다.
   7. 화면 오른쪽에서 채널 A를 선택합니다.
   8. 이미지를 명확하게 볼 수 있도록 히스토그램 설정을 조정합니다.
      참고: 필요에 따라 업데이트해야 합니다.
   9. 모터 컨트롤러의 모터 설정을 Base로 설정합니다.
   10. 물고기가 보일 때까지 대물렌즈를 내립니다.
       알림: 대물렌즈가 머리에 물리적으로 닿지 않도록 하십시오.
   11. 물고기 머리의 중심을 시야 중앙에 놓습니다.
   12. 목표를 위로 이동하여 물고기 머리에서 멀어지게 합니다.
   13. 3PM(3광자 현미경)용 저배율 대물렌즈를 고개구수(NA) 대물렌즈로 교체합니다.
       참고: 저배율 렌즈와 고NA 대물렌즈는 동초점일 필요는 없지만 물고기가 고NA 대물렌즈의 시야 내에 있는지 확인할 수 있을 만큼 충분히 가까워야 합니다.
   14. 대물렌즈가 머리에 물리적으로 닿지 않도록 대물렌즈를 천천히 내립니다. CCD 카메라 소프트웨어에서 머리 꼭대기가 보이면 대물렌즈 이동을 중지합니다. z 위치를 0 μm.
       로 설정합니다. 참고: 침수 대물렌즈를 사용할 때 대물 렌즈 아래에 기포가 없는지 확인하십시오.
   15. LED 광원을 끄고 시스템 주변의 어두운 커튼을 닫습니다.
   16. 3P 이미징을 위해 이미징 획득 소프트웨어를 다광자 GG 모드로 설정하고 대물 렌즈 아래의 출력을 1 mW 미만(~1 MHz 펄스 반복률 포함)으로 설정합니다.
   17. 모터 컨트롤러에서 모터 설정 버튼을 Base에서 Objective로 변경합니다.
   18. 방의 조명을 끕니다.
   19. 광전자 증배관(PMT)을 켜고 3PM 여기 소스 셔터를 엽니다. 자가형광으로 인한 형광 신호 채널과 뼈의 THG로 인한 3차 고조파 발생(THG) 신호 채널에 뼈의 윤곽이 나타나는지 확인합니다(그림 1C).
   더
   20. 깊이 이미징할 때 파워 레벨을 높여 다양한 깊이에서 이미징을 수행합니다.

결과

그림 1: 물고기의 생체 내 이미징에 대한 대표적인 스크린샷(프로토콜 섹션 1). (ᅡ) 4x 대물 렌즈가 있는 이미지 획득 소프트웨어의 카메라 모드 보기. 소프트웨어의 주요 기능은 다음과 같이 요약되고 번호가 매겨져 있습니다. 1. 이미지 획득 소프트웨어의 이미징 모드. 모드 옵션은 카메라, 다광자 및 다광자 GG

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5% 포비돈-요오드	Amazon	NDC 67818-155-32	수술 부위의 관증적 세척
70% 에탄올	Thermo Fisher Scientific CAS	64-17-5	수술 부위의 관증적 세척
Agarose	Sigma	A4718-256	제브라피쉬 챔버 준비
Bergamo II	Thorlabs		다광자 이미징 현미경
부피바카인	코넬 수의학 치료
GaAsP 증폭 PMT	Thorlabs	PMT2100	PMT 검출기
히터(800W)	제브라피쉬 물용 Finnex
Kimwipes	브라피쉬 준비를 위한	Kimtech
36G 바늘이 있는 나노필 주사기(10마이크로미터)	WPI	NANOFIL + NF36BV	판쿠로늄 브로마이드 주사용 주사기 및 바늘
동 펌프	원소 과학	ESI MP2	제브라피쉬 설정용 워터 펌프
폴리에틸렌 튜브(내경 0.58mm, 외경 0.965mm)	원소 과학	MP2 펌프 튜브	제브라 피쉬의 입에 들어가는 튜브
SR400	탠포드 리서치 시스템	SR400	광자 카운터
표준 포토 다이오드 파워 센서	Thorlabs	S122C	파워 디텍터
은 스트립 복싱 왁스	코닝 고무 주식회사		제브라피쉬 챔버에 튜브를 제자리에 고정
ThorImage	Thorlabs		이미지 수집 소프트웨어
트리카인(에틸-m-아미노벤조에이트 메탄술폰산염)	MP	103106	제브라피쉬 마취 및 안락사
타이곤 튜브(내경 1/16인치, 외경 1/8인치)	제브라피쉬 준비용 물 흐름용	Tygon
VaporGuard	VetEquip	931401	소플루란 재활용용
Vetbond 조직 접착제	3M	1469SB	쥐 두개골에 유리창을 붙이고 물고기를 준비할 때 실험실 조직을 붙입니다.
XLPLN25XWMP2	Olympus		다광자 여기 전용 대물렌즈

수족관 히터)제 실험실 조직 연 스 얇 튜브 이