3광자 형광 현미경을 사용한 제브라피쉬 뇌의 심부 조직 이미징

Abstract

출처: Hontani, Y., et al. 온전한 마우스와 제브라피쉬 뇌의 심부 조직 3광자 형광 현미경. J. Vis. 경험. (2022년)

이 비디오는 마취된 제브라피쉬 뇌에서 3광자 이미징의 설정 및 실행을 보여줍니다. 이 프로토콜은 형광 표지된 뉴런의 심부 조직 시각화를 가능하게 하여 신경과학 연구 응용 분야를 위한 실시간 뉴런 활동 및 구조를 밝힙니다.

Protocol

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 제브라피쉬 뇌의 생체 내 이미징
   참고: 대물 렌즈 아래에서 물고기 뇌를 올바르게 찾기 위해 광시야 이미징을 위한 여기광과 동일한 경로에 2차 전하 결합 장치(CCD) 카메라가 사용됩니다.
   
   1. 현미경을 설정하고 파워를 보정합니다.
   2. 저배율(일반적으로 4배) 대물렌즈를 현미경에 놓습니다.
   3. 생선과 튜브가 들어 있는 페트리 접시를 현미경 아래에 놓습니다.
   발
   4. 광 다이오드(LED) 광원을 사용하여 페트리 접시를 비춥니다.
   5. 이미지 획득 소프트웨어의 카메라 모드를 엽니다(그림 1).
   6. 라이브를 클릭합니다.
   7. 화면 오른쪽에서 채널 A를 선택합니다.
   8. 이미지를 명확하게 볼 수 있도록 히스토그램 설정을 조정합니다.
      참고: 필요에 따라 업데이트해야 합니다.
   9. 모터 컨트롤러의 모터 설정을 Base로 설정합니다.
   10. 물고기가 보일 때까지 대물렌즈를 내립니다.
       알림: 대물렌즈가 머리에 물리적으로 닿지 않도록 하십시오.
   11. 물고기 머리의 중심을 시야 중앙에 놓습니다.
   12. 목표를 위로 이동하여 물고기 머리에서 멀어지게 합니다.
   13. 3PM(3광자 현미경)용 저배율 대물렌즈를 고개구수(NA) 대물렌즈로 교체합니다.
       참고: 저배율 렌즈와 고NA 대물렌즈는 동초점일 필요는 없지만 물고기가 고NA 대물렌즈의 시야 내에 있는지 확인할 수 있을 만큼 충분히 가까워야 합니다.
   14. 대물렌즈가 머리에 물리적으로 닿지 않도록 대물렌즈를 천천히 내립니다. CCD 카메라 소프트웨어에서 머리 꼭대기가 보이면 대물렌즈 이동을 중지합니다. z 위치를 0 μm.
       로 설정합니다. 참고: 침수 대물렌즈를 사용할 때 대물 렌즈 아래에 기포가 없는지 확인하십시오.
   15. LED 광원을 끄고 시스템 주변의 어두운 커튼을 닫습니다.
   16. 3P 이미징을 위해 이미징 획득 소프트웨어를 다광자 GG 모드로 설정하고 대물 렌즈 아래의 출력을 1 mW 미만(~1 MHz 펄스 반복률 포함)으로 설정합니다.
   17. 모터 컨트롤러에서 모터 설정 버튼을 Base에서 Objective로 변경합니다.
   18. 방의 조명을 끕니다.
   19. 광전자 증배관(PMT)을 켜고 3PM 여기 소스 셔터를 엽니다. 자가형광으로 인한 형광 신호 채널과 뼈의 THG로 인한 3차 고조파 발생(THG) 신호 채널에 뼈의 윤곽이 나타나는지 확인합니다(그림 1C).
   더
   20. 깊이 이미징할 때 파워 레벨을 높여 다양한 깊이에서 이미징을 수행합니다.

Results

그림 1: 물고기의 생체 내 이미징에 대한 대표적인 스크린샷(프로토콜 섹션 1). (ᅡ) 4x 대물 렌즈가 있는 이미지 획득 소프트웨어의 카메라 모드 보기. 소프트웨어의 주요 기능은 다음과 같이 요약되고 번호가 매겨져 있습니다. 1. 이미지 획득 소프트웨어의 이미징 모드. 모드 옵션은 카메라, 다광자 및 다광자 GG

Materials