타임랩스 스캐닝 공초점 현미경을 사용한 교모세포종 조직에서 종양 세포 이동 이미징

초록

출처: Parker, J. J., et al. 항침습적 약물의 종양 세포 이동 및 환자 특이적 효과 연구를 위한 인간 교모세포종 기관형 절편 배양 모델. J. Vis. 경험. (2017년)

이 비디오는 공초점 현미경을 통해 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 교모세포종 조직 절편의 이미징을 보여줍니다. 고해상도 이미지는 종양 세포의 움직임과 방향을 추적하기 위해 일관된 간격으로 캡처됩니다.

프로토콜

샘플 수집과 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 레트로바이러스를 발현하는 녹색 형광 단백질을 통한 종양 세포 표지

참고: 종양 세포 이동 분석을 위한 타임랩스 현미경은 슬라이스 배양 내 세포의 안정적이고 장기적인 형광 표지를 필요로 합니다. 레트로바이러스의 사용은 분열 세포를 선택적으로 감염시켜 슬라이스 내에 존재하는 미세아교세포 또는 다른 세포 유형과 달리 종양 세포 집단 내에서 형광 표지를 풍부하게 하기 때문에 제안됩니다. 감염의 표준화는 10⁴ CFU/μL의 바이러스 역가가 세포 이동의 추적 및 분석을 위한 충분한 녹색 형광 단백질 발현을 초래한다는 것을 시사합니다. 증가된 바이러스 역가, 비선택적 바이러스(즉, 아데노바이러스, 렌티바이러스) 또는 모든 세포를 표지하는 기타 수단은 이동 중에 명확한 세포 경계의 식별을 배제하여 분석을 복잡하게 만들 수 있습니다. 필요에 따라 대체 형광 마커를 활용하고 최적화할 수 있습니다.

1. 표준 프로토콜5,14 또는 상업적으로 이용 가능한 소스를 통해 종양 절편 감염을 위한 레트로바이러스를 얻으십시오. 보충되지 않은 뉴런 배지에 적절한 부피를 첨가하여 바이러스 상청액을 희석하여 10⁴ CFU(콜로니 형성 단위)/μL의 바이러스 역가를 달성합니다.
2. 배양 7 - 10일 사이에 관심 있는 종양 절편 배양물을 5 - 10 μL의 바이러스(10⁴ CFU/μL)로 감염시킵니다. 바이러스를 각 조직 조각의 표면에 부드럽게 떨어뜨립니다. 슬라이스가 인서트 표면에 떠 있는 경우 추가되는 상청액 부피를 줄입니다. 슬라이스 배양이 포함된 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다.
3. 바이러스 감염 후 24시간부터 시작하여 표지된 종양 세포에 대한 절편을 평가합니다. 이 시간 지연은 바이러스 혼입 및 형광 유전자 발현 동역학에 따라 달라집니다. 여기에 사용된 바이러스 구조의 경우, 표준 낙산화형광 현미경으로 강력한 형광 신호를 관찰하는 데 72시간이 필요했습니다.
   참고: 드물게 슬라이스가 바이러스 표지 세포의 주로 말초 분포를 나타내며, 이는 공초점 이미징을 복잡하게 만들 수 있습니다. 이러한 복잡성을 방지하려면 슬라이스 두께와 슬라이스 전체의 두께 변화를 줄이십시오. 슬라이스 배양이 중앙 근처에 더 두꺼운 영역을 가지고 있는 경우 적절한 영양분 침투를 방해하여 활발하게 분열하는 종양 세포의 개체군을 제한할 수 있습니다. 이 합병증을 스크리닝하기 위한 정성적 분석은 테트라졸륨 염료 시약(즉, MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드))을 슬라이스 배양 배지에 추가합니다. 시약을 첨가한 후 파란색으로 변하지 않는 슬라이스 영역은 대사 활동이 부족하고 슬라이스 건강이 손상되었음을 나타냅니다.

2. 종양 세포 이동의 타임랩스 단일 광자 레이저 스캐닝 공초점 이미징

참고: 성공적인 형질도입 및 배양의 건강이 확인된 후 제어 조건에서 세포를 이미징한 후 치료 조건에서 동일한 기간의 이미징을 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 세포를 성공적으로 이미지화하고 각 조건에서 12시간 동안 추적했습니다. 그러나 더 짧거나 더 긴 기간 이미징 및 환경 조작도 유익할 수 있습니다.

1. 현미경 로드<ol style='list-style-type:decimal;'>
2. 이미징하기 전에 1mL의 신선한 슬라이스 미디어를 유리 바닥 접시에 넣으십시오.
3. 유리 바닥 접시의 배지를 인큐베이터에서 15분 동안 평형을 이기도록 합니다.
   참고: 이 시점에서 형광 접합 렉틴(즉, 미세아교세포 표지를 위한 이솔렉틴 IB4) 또는 리간드 접합 양자점과 같은 가용성 표지제를 이미징 중 세포 하위 집단의 식별을 위해 슬라이스 배양 배지에 첨가할 수 있습니다.
4. 층류 후드에서 멸균 겸자를 사용하여 이미지화할 인서트를 유리 바닥 접시로 옮깁니다. 접시를 현미경 단계로 운반합니다.
5. 밀봉된 현미경 스테이지 탑 인큐베이터에서 37°C 및 5% CO₂ 분위기에서 슬라이스 배양을 유지합니다. 과도한 배지 증발을 방지하기 위해 가능한 경우 배양 챔버의 멸균 H₂O 가습을 활용하십시오(특히 긴 이미징 실험에 중요).
6. 단일 광자 및/또는 다중 광자에 대해 긴 작동 거리 10X 공기 대물렌즈 및 레이저 여기를 갖춘 공초점 현미경을 활용합니다. 메모: 현미경 대물 렌즈가 적절한 작동 거리를 제공하는지 확인하십시오. 스테이지 상단 인큐베이터, 유리 바닥 접시 및 조직 배양 인서트의 높이가 추가되었기 때문에 장거리 대물렌즈가 중요합니다.
7. 유리 바닥판을 고정하고 플라스틱 페트리 접시 덮개를 제거한 다음 가스 투과성 멤브레인으로 덮습니다.

이미지 획득

1. 현미경을 사용하여 슬라이스를 육안으로 검사하고 슬라이스 가장자리와 중심 사이에 형광 표지된 종양 세포의 적절한 밀도가 있는 적절한 필드를 찾습니다. 이미징 중 조직 이동의 민감성이 증가하기 때문에 슬라이스 가장자리의 이미징 필드를 피하십시오. 이러한 이동을 제한하기 위해 조직 슬라이스 하프를 사용할 수 있습니다.
2. 다차원 분석 모드에서 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지화할 모든 위치에 가시 형광 셀룰러 신호가 포함되도록 첫 번째(하단) 및 마지막(상단) Z-스택 경계를 설정합니다. 10μm의 일정한 Z-스텝으로 슬라이스의 150 - 200μm를 통한 이미징은 세포 경로 추적에 적절한 해상도를 제공했습니다(개별 이미징 요구 사항에 맞게 조정할 수 있음).
3. 현미경에 전동 스테이지가 있는 경우 각 Z-스택 획득에 적절한 시간이 허용되는지 확인하십시오. 획득 사이의 시간 간격을 위치당 동일한 스캔 시간 x 이미지화 위치 수(즉, 이미지화된 종양 영역)로 설정합니다.
   참고: 녹색 및 적색 형광단의 동시 여기를 위해서는 488nm 및 633nm 동시 여기와 함께 이중 라인 레이저 라인 스캐닝 프로그램을 활용하십시오. 선택된 레이저 여기의 파장은 발현되는 개별 형광 단백질에 따라 달라집니다.
4. 이미지화된 종양 영역 사이에 균일한 레이저 출력과 공초점 핀홀 설정을 유지합니다. 광독성을 제한하기 위해 종양 세포 본체와 과정을 명확하게 구분하는 데 필요한 가장 낮은 레이저 출력 설정을 활용합니다. 특정 이미징 매개변수 단위(예: 파워 및 컨포칼 핀홀 설정)는 현미경 및 레이저 소스 사양에 따라 다릅니다.
5. 대물렌즈를 향해 전진하는 초점면에 2 - 3개의 "버퍼" Z-스택 단계를 추가하여 잠재적인 매체 증발을 보상합니다. 이것은 조직이 수직면에서 Z-스택 획득 범위를 벗어나는 것을 효과적으로 방지합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM High Glucose	Invitrogen (Gibco)	11960-044
Neurobasal-A Medium, minus phenol red	Invitrogen (Gibco)	12349-015
B-27 보충제(50X), 무혈청	Invitrogen (Gibco)	17504-044
페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)	인비트로젠 (Gibco)	15140-122
글루타맥스 보충제	인비트로젠 (Gibco)	35050-061
L-글루타민 (200 mM)	인비트로젠 (Gibco)	25030-081
HEPES (1 M)	인비트로젠 (Gibco)	15630-080
니스타틴 현탁액	Sigma-Aldrich	N1638-20ML	10,000 unit/mL DPBS, 무균 처리, BioReagent, 세포 배양에 적합
UltraPure 저융점 Agarose	Invitrogen(Gibco)	16520-050	은 65.5°C에서 녹고 37°C에서 유동성을 유지하며 25°C 이하에서 빠르게 경화됩니다.
Griffonia simplicifolia의 Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 647 Conjugate	Thermo Fisher (Molecular Probes)	I32450	미세아교세포/대식세포를 표지하기 위해 배지에 사용
pRetroX-IRES-ZsGreen1 벡터	Clonetech	632520
Retro-X Concentrator	Clonetech	31455	바이러스 상청액의 비초원심분리 농축용 결합 수지
pVSG-G 벡터	Retro-X 범용 레트로바이러스 발현 시스템	Clonetech	631530
	Retro-X		범용 레트로바이러스 발현 시스템의 일부
아노아크릴레이트 접착제(슈퍼 접착제)	Sigma-Aldrich	Z105899	중간 점도
Peel-A-Way 포매 몰드(정사각형 - S22)	Polysciences, Inc.	18646A-1	종양 샘플 포매용 금형
스테인레스 스틸 마이크로 주걱	Fisher Scientific	S50823	숟가락 칼날 목에서 45도 구부
Curved Fisherbrand 해부 미세한 집게	Fisher Scientific	08-875
싱글 에지 면도날(American Safety Razors)	Fisher Scientific	17-989-001	블레이드 가장자리의 두께는 0.009인치입니다. 압착된 뭉툭한 가장자리 덮개는 진동 절개에 적재하기 전에 제거됩니다.
라이카 VT1000 S 진동 극복	카 바이오시스템즈	VT1000 S
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35mm 유리 바닥 접시	MatTek	P35G-1.5-20-C 슬리브	20mm 유리 직경. 커버슬립 유리 두께 1.5
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