성상세포의 구획 특이적 역학을 위한 자발적 칼슘 이미징

초록

출처: Bannai, H., et. al., 막 표적 Ca2+ 지표에 의한 배양 세포의 국소 Ca2+ 신호 해부. J. Vis. Exp. (2019년)

이 비디오는 원형질막과 소포체에 국한된 칼슘 민감성 단백질을 순차적으로 모니터링하여 성상세포에서 구획 특이적 자발적 칼슘 역학을 관찰하기 위한 형광 이미징을 보여줍니다.

프로토콜

1. Ca²⁺ 이미징

1. Lck-RCaMP2 및 OER-GCaMP6f/
   를 발현하는 성상세포의 자발적인 활동 기록 참고: 이미지 분할 광학 장치가 없으면 원형질막과 소포체(ER) 주변의 Ca²⁺ 신호를 동일한 세포에서 모니터링할 수 있습니다. 여기에서는 동일한 성상세포에서 Lck-RCaMP2(원형질막 표적 유전적으로 암호화된 Ca²⁺ 지표) 및 OER-GCaMP6f(외부 소포체막 표적 유전적으로 암호화된 Ca²⁺ 지표)의 순차적 기록을 설명합니다. 개구수가 1.3보다 큰 오일 이지전 대물렌즈는 자발적인 Ca²⁺ 활성에 적극 권장됩니다.
   1. 기록하기 전에 현미경, 카메라, 광원 및 현미경 가열 챔버를 최소 30분 동안 켜십시오.
   2. Lck-RCaMP2 및 OER-GCaMP6f로 형질감염된 세포가 들어 있는 커버슬립을 기록 챔버에 장착하고 이미징 배지 400μL를 추가합니다. 챔버 위에 뚜껑을 놓습니다.
   3. GCaMP6f 및 광원(파란색 여기광, 예: 470-490nm, 재료 표 참조)에 대한 필터 세트를 선택합니다. OER-GCaMP6f를 발현하는 성상세포를 찾습니다.
   4. RCaMP2에 대한 필터 세트와 광원(녹색 여기광, 예: 510–560nm, 재료 표 참조)을 선택하고 Lck-RCaMP2가 동일한 성상세포에서 발현되는지 확인합니다. 광표백을 방지하기 위해 광원에 장시간 노출되지 않도록 하십시오.
   5. Lck-RCaMP2의 타임랩스 이미지를 2Hz에서 2분 동안 기록합니다. 이미징 데이터를 HDD에 저장합니다.
   6. 필터 세트를 GCaMP6f에 대한 필터 세트로 변경합니다. OER-GCaMP6f의 타임랩스 이미지를 2Hz에서 동일한 시야에서 2분 동안 기록합니다. HDD에 데이터를 저장합니다.
   7. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
18mm 직경의 원형 커버슬립	Karl Hecht "Assistent"	#41001118	두께 1, 직경 18mm의 원형 커버슬립; 대체 커버슬립을 사용할 수 있습니다.
현미경 이미지 기록			냉각 CCD 카메라(예: Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD 카메라(예: Hamamatsu Photonics, ImagEM; Andor, iXon) 또는 CMOS 카메라(예: Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)Metamorph
(Molecular Devices), Image J(NIH) 및 TI Workbench14(맞춤형)와 같은	이미지 분석 소프트웨어
매체 및 완충액			실험에 최적의 매체 또는 완충액을 사용합니다. 배지를 사용하는 경우, 배경 형광을 감소시키기 위해 페놀 레드가 없는 배지가 바람직하다. 20mM HEPES를 첨가하여 이산화탄소 인큐베이터 외부의 pH를 유지합니다.
IX73(Olympus) 또는 Eclipse TI(Nikon Instech)와 같은	도립 형광 현미경
GCaMP6f 이미징			GFP에 적합한 필터(여기, 480 ± 10 nm, 방출, 530 ± 20 nm)
RCaMP2 이미징			RFP에 적합한 필터(여기, 535 ± 50 nm, 방출, 590 nm 롱 패스)
현미경 가열 시스템			이미징 중에 세포를 37°C로 유지하는 가열 시스템입니다. 열팽창으로 인한 드리프트를 방지하려면 현미경 전체를 덮는 가열 시스템(예: Tokai Hit, Thermobox)을 사용하는 것이 좋습니다.
		현미경 광원	은 램프(100W), 크세논 램프(75W), 발광 다이오드(LED) 조명 시스템(예: CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4파장 LED 소스; Lumencor, SPECTRA X 라이트 엔진). 수은 덩어리와 크세논 램프의 경우 ND 필터를 사용하여 여기 강도를 줄이십시오.
구수가 1.3보다 높은 현미경 대물 렌즈 Plan-Apochromat 오일 침지 대물렌즈는 뉴런 및 성상세포에서 자발적인 Ca²⁺ 활동을 기록하는 데 적극 권장됩니다.
기록 챔버	Elveflow	Ludin Chamber	이 기록 챔버는 직경 18mm의 원형 커버슬립용입니다.
실체현미경			마를 해부하는 데 사용됩니다. Olympus SZ60 또는 동급의 실체현미경을 사용할 수 있습니다.

용 카메라 이미징 용 현미경 필터 세트 용 현미경 필터 세트 여기용 수개 해