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나이프 - 에지 스캐닝 현미경에 대한 표본 준비, 이미징 및 분석 프로토콜

DOI:

10.3791/3248

⸱

December 9th, 2011

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Computer Science and Engineering, Texas A&M University, 2Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Kettering University, 43Scan, 5Department of Veterinary Integrative Biosciences, Texas A&M University

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy
Posted by JoVE Editors on 4/07/2013. Citeable Link.

A correction was made to Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

Summary

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뇌 표본 준비에서 데이터 시각화 및 분석에, 나이프 - 에지 스캐닝 현미경을 사용하여 시리얼 sectioning 이미징의 전체 과정을 설명합니다. 이 기술은 현재 마우스 뇌 데이터를 취득하는 데 사용하지만, 다른 기관, 다른 수종에 적용됩니다.

Abstract

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높은 처리량, 높은 해상도, 3D 현미경 기술의 주요 발전 submicrometer 해상도 neuroanatomical 큰 데이터 볼륨의 인수를 사용할 수있다. 전체 - 뇌 규모의 데이터를 생산 최초의 악기 중 하나는 나이프 - 에지 스캐닝 현미경 (KESM) 7, 5, 9, 개발 및 저자의 실험실에서 호스팅됩니다. KESM는 복잡한의 연결 네트워크의 세부 사항 (잠돌군 Zz) 1, 4, 8, 혈관 네트워크 (인도 잉크) 1, 4, 및 세포 본문 배포 (Nissl) 3 공개, 섹션 및 submicrometer 해상도에서 이미지 전체를 마우스 뇌에 사용되고 있습니다 . KESM의 사용은 마우스이나 두뇌에 제한되지 않습니다. 우리는 성공적으로 문어의 두뇌 6, 마우스 폐, 및 쥐 두뇌를 몇 군데있다. 현재 전체 제브라 다 니오의 배아에 노력하고 있습니다. microcirculation 및 hemodynamic 연구,, 이런 데이터는 크게 connectomics 연구 10 기여할 수 있으며, provi에 의해 stereology 연구에땡 지상 진실을 정확하게.

이 문서에서는, 우리는 표본 준비 (고정, 얼룩 및 포함)를 포함 파이프라인, KESM 구성 및 설정, sectioning 및 이미징 KESM와 함께, 이미지 처리, 데이터 준비, 데이터 시각화 및 분석에 대해 설명합니다. 강조 표본 준비와 얻은 KESM 데이터의 시각화 / 분석됩니다. 우리는이 문서에서 제시한 자세한 프로토콜 KESM하고 활용도를 높이기 위해 접근을 확대 데 도움을 기대합니다.

Protocol

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1. 표본 준비 : 잠돌군 Zz - 콕스

  1. 이 프로토콜은 밀접하게 Mayerich 외의 프로토콜. 7을 따릅니다.
  2. C57BL/6J 마우스 isoflurane 흡입 마취를 사용하여 깊은 anesthetized하고 다음 참수.
  3. 두뇌는 잠돌군 Zz - 콕스 고정 솔루션 (1 % 칼륨의 크롬, 1 % 칼륨 dichromate, 그리고 탈이온수에 1퍼센트 mercuric 염화)로 제거하고 배치됩니다.
  4. 두뇌는 10~16주 동안 상온에서, 어둠 속에서 잠돌군 Zz - 콕스 솔루션에 남아있다.
  5. 두뇌는 어둠 속에서 밤새 탈이온수에 씻어서 있습니다.
  6. 씻어서 두뇌는 상온에서 어둠 속에 7-10일 위해 탈이온수에 5 % 수산화 암모늄 용액에 포장되어 있습니다. 이 긴 준비 시간은 검은 침전물이 완전히 조직 형태에 대한 기회가되도록, 전체 두뇌의 침투를 보장하는 것이었다.
  7. 두뇌는 4 시간 t에 대한 실온에서 탈이온수 다시 씻어서입니다실온에서 50 % 70% 냉장고 (4 ° C)에서 85 %, 95 % (3 변경) 및 100 % (4-5 변경) : 등급 에틸 알콜의 시리즈를 통해 탈수 암탉. 두뇌는 24 시간 동안 각각의 용액에 남아 있습니다.
  8. 탈수 두뇌는 다음 1시 2분의 araldite - 투 - 아세톤 비율 1시 1분, 2시 1분, 마지막에있는 araldite - 아세톤 혼합하여 다음 (3-4 변경, 하루마다) 아세톤에 들어가게된다 냉장고에 100 % araldite (3 변화, 하루 때마다), (4 ° C).
  9. 마지막으로 치료 두뇌는 100 % araldite에 포함된 및 ° C 삼일 (애보트와 Sotelo 2를 참조하라의 내장 프로토콜)에 대한 60 가열합니다.
    표본은 LR 화이트에 포함된 경우 다음 표본 전에 중합에 대한 표준 절차 각 하룻밤 냉장고에 보관 LR 화이트 솔루션의 세 변화를 통해 지난 100 % 에탄올 용액에서 전송됩니다. 세 가지 변경 사항은 전체 침입을 보장하기 위해 수행됩니다. 표본은 t이다60 닫힌 용기에 polymerized는 신선한 LR 화이트로 전송 암탉 ° 적절한 중합 시간 및 온도의 필요한 금액 24 시간 C,.
  10. 그림. 1 Araldite에 포함된 잠돌군 Zz - 콕스 묻은 머리를 보여줍니다.
  11. 완치 표본 블록은 다음 에폭시를 사용하여 금속 표본 링에 장착하고, 블록의 측면은 (그림을 참조하십시오. 2) 필요로 손질합니다.

2. 표본 준비 : Nissl

  1. 마우스 케타민을 및 xylazine (1.7 MG 케타민을 / 20g의 체중 당 0.26 MG의 xylazine) 주입 intraperitoneally를 사용하여 깊은 anaesthetized하고 다음 transcardially 실온 50 ML을 사용 perfused 인산 버퍼 객실 250 ML 다음 염분을 (산도 7.4) 온도 중립 10 % (산도 7.4) 포르말린을 버퍼. 그리고 마지막으로 undiluted 인도 잉크의 3.0 CC와 함께.
  2. 염분과 정착액과 함께 온몸 재관류는 심장 혈관 시스템에서 혈액을 취소하고 TI를 해결하는 데 필요한 ssues. 인도 잉크와 재관류 완전히 심장 혈관 시스템의 vasculature을 채우기 위해 필요합니다.
  3. 그 결과 뇌는 등급 에틸 알콜 (25 % -100 %)의 시리즈를 통해 다음 탈수하고 다음 위의 1.8-1.9에서 다음과 같은 프로토콜 araldite 플라스틱에 포함된. LR 화이트 포함 매체있다면 위의 1.10의 프로토콜은 다음입니다.

4. 표본 준비 : 일반 종, 일반 기관

  1. 일반적인 경우를, 고정가 중 10% 중성 포르말린 버퍼 또는 4 % paraformaldehyde로 할 수 있습니다.
  2. 작은 조직 볼륨 대신 재관류의 보급은 고정 및 얼룩을 권장합니다. 작은 생물이나 기관의 경우도 얼룩은 탈수 과정에서 할 수 있습니다.
  3. 솔루션 침투를위한 시간이 기관 또는 전체 마우스 뇌보다 훨씬 작은 생물에 대한 줄일 수 있지만 내장 프로토콜은 상기와 동일합니다.
jove_title "> 5. KESM 설정 및 이미징
  1. 펌프를 끄고, 무대 설정 카메라 설정, 조명기 켭니다.
  2. 나이프와 목적을 올립니다.
  3. 표본 반지를 설치합니다.
  4. 측정 표본의 크기와 KESM 스테이지 Controller2 응용 프로그램 구성 파일을 만듭니다.
  5. KESM 단계 Controller2를 시작하고 무대를 초기화합니다.
  6. 낮은 칼 / 목표, 펌프를 켜십시오.
  7. 광학 기차에 초점 노브를 돌려 칼날에 상대적인보기의 카메라의 필드를 조정하여, 객관적이고 카메라를 중점을두고 있습니다.
  8. 이미징을 시작 [이동]을 누르십시오.
  9. 참조은 무화과. 3-8. 기술적인 세부 9, 7을 참조하십시오.

6. 영상 처리 및 데이터 준비

  1. 설정 파일 폴더 (00000, 00001 등)에서 데이터 폴더로 KESM 스택 프로세서 실행 파일을 복사합니다.
  2. 조명 유물을 제거하고 모든 배경 강도를 정상화하기 위해 KESM 스택 프로세서를 실행이미지를 표시합니다. 모든 데이터 하위 폴더에 대한 반복합니다.
  3. 데이터 multiscale 타일을 준비 설정하고 업로드하고 KESM 두뇌 아틀라스 웹 서버에있는 파일을 설정합니다.
  4. 그림을 참조하십시오. 9.

7. 데이터 시각화 및 분석

  1. KESM 뇌 아틀라스를 사용하여 시각화. 이동 http://kesm.cs.tamu.edu 하고 해당 아틀라스를 선택합니다.
    1. Google지도에서와 같이 이동합니다.
    2. Google Maps에로와 축소.
    3. [-] Z 깊이를 증가 또는 감소에 다른 깊이로 이동하려면, 중 [+] 또는 누른 다음 풀다운 메뉴에서 각각의 단계에서 이동하는 방법에 깊이를 선택합니다.
    4. 풀다운 메뉴를 사용하여 오버레이 번호를 조정합니다.
    5. 풀다운 메뉴를 사용하여 오버레이 간격을 조정합니다.
    6. 그림을 참조하십시오. 11.
  2. MeVisLab를 사용하여 시각화.
    1. MeVisLab를 시작합니다.
    2. 새 프로젝트를 만듭니다.
    3. 다음에, 새로운 모듈을 타이로 만들 수 있습니다명령 상자에서 모듈 이름으로 Ping을 실행합니다.
    4. 생성 모듈 [Compose3Dfrom2DFiles], 그리고 원하는 폴더로 이동합니다. 파일 문자열을 입력하고 [GetFileList]을 클릭합니다. 선택된 이미지가 메모리에 들어갈 수 있는지 확인하십시오. 클릭하여 [Create3D]는 볼륨을 만들 수 있습니다.
    5. 생성 모듈 [SetWorldMatrix] 아래에 "크기 조정"을 설정 해당 voxel 크기 (0.6, 0.7, 10X 0.45NA 목적을 위해 1.0)로 X, Y, Z "를 초등학교가 변환". 링크 [Compose3Dfrom2DFiles]을 [SetWorldMatrix].
    6. 매트릭스를 설정하고 "앞으로", "무시", "무시"를 "매트릭스 구성"아래 변환.
    7. 생성 모듈 [Arithmetic1]와 "(맥스 IMG) 반전"에 "기능"을 설정합니다.
      링크 [SetWorldMatrix]을 [Arithmetic1].
    8. 생성 모듈 [View3D] 및 [Arithmetic1]를 연결합니다.
    9. View3D에서 마우스 오른쪽 버튼을 누를 동안 임계값을 조정 주위 마우스를 이동합니다. 당신은 지역 변경 방향 (왼쪽 마우스 버튼을 누를있는 동안 마우스 이동), 변경 조명을 (볼륨 renderin 작물 수 있습니다G 또는 MIP) 등에 / 배경 해제
    10. 그림을 참조하십시오. 10.

8. 대표 결과 :

여기, 우리는 전체 - 뇌 데이터와 정보를 제시한다. 무화과. 12-15보기 전체 - 뇌 인도 잉크, 잠돌군 Zz, 그리고 Nissl 데이터는 1, 4, 3을 설정합니다.

figure-protocol-1
그림 1., 고정 스테인드 및 임베디드 마우스 뇌

figure-protocol-2
그림 2. 임베디드 마우스 뇌 표본은 표본 링에 장착.

figure-protocol-3
그림 3. 나이프 에지 스캐닝 현미경 (KESM). KESM의 사진은 자사의 주요 구성 요소가 표시와 함께 표시됩니다 : (1) 고속 라인 스캔 카메라 (2) 현미경의 목적, (3) 다이아몬드 나이프 어셈블리 및 조명 콜리 메 이터를 (4) specimen 탱크 (물 침지 영상에 대한), (5) 세 축 정밀 에어 베어링 스테이지 (6) 흰색 가벼운 현미경 조명기, sectioned 조직의 제거 (7) 펌프 (뒤쪽), (8) 무대 제어 및 이미지 수집, (9) 화강암베이스, 그리고 (10) 화강암 다리를 PC 서버.

figure-protocol-4
그림 4. KESM의 이미징의 원칙. KESM 운영의 주요한는 그림입니다. 객관적이고 나이프는 (폭 5mm 표본 20 NM 및 1-5의 여행 속도의 해상도에서 위치 단계 이동 (실선과 화살표)에 부착된 동안 장소에서 개최되며, 다이아몬드 나이프에 대한 스크랩한 도착 10X 목적을 위해), 칼 (실선과 화살표)를 통해 흐르는 얇은 섹션을 생성. 라인 스캔 영상은 칼로의 매우 끝 가까이에 이루어집니다.

figure-protocol-5
그림 5. KESM 카메라와 목표를 중심으로 제어합니다.

figure-protocol-6
그림 6. KESM 나이프 어셈블리 및 제어합니다.

figure-protocol-7
그림 7. 관측 포트를 통해 초점을 초기.

figure-protocol-8
그림 8. KESM 스테이지 컨트롤러 2 응용 프로그램 (스크린샷).

figure-protocol-9
그림 9. KESM 스택 프로세서 응용 프로그램 (스크린샷).

figure-protocol-10
그림 10. MeVisLab 응용 프로그램 (스크린샷).

figure-protocol-11
그림 11 KESM 뇌 아틀라스 :. 웹 인터페이스 (스크린샷).

figure-protocol-12
그림 12. KESM 전체 - 뇌 인도 잉크 데이터입니다. KESM 데이터 스택의 볼륨 시각화는 혈관 데이터 집합에 대한 표시됩니다. (A) 클로즈업 혈관 데이터. 폭 ~ 100 음. 전체 마우스 뇌 vasculature의 (BD) 3 표준보기 (고해상도 데이터 subsampled). 너비는 10mm ~.

figure-protocol-13
그림 13. KESM 전체 - 뇌 마우스 잠돌군 Zz 데이터입니다.

figure-protocol-14
그림 14. KESM 잠돌군 Zz 데이터 세부 사항.

figure-protocol-15
그림 15. KESM 전체 - 뇌 Nissl 데이터입니다. (A) 클로즈업 N의issl 데이터가 없습니다. ~ 300 음 3. 전체 마우스 뇌 Nissl 데이터 (BD) 3 표준보기 (고해상도 데이터 subsampled). 크로스 섹션은 내부 구조의 명확한 보려면 표시됩니다.

Discussion

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KESM은 생물 학적 표본 (~ 1cm 3) 대량의 submicrometer 수준의 조사를 허용합니다. 볼륨의이 종류가 같은 뇌, 폐, 심장, 신장 등 모든 작은 동물 장기를 가질 정도이며, 등 이러한 기관의 구조 조직에 대한 전례없는 양적 정보를 제공하고, 다양한 기능의 전산 모델링을 활성화할 수 같은 기관에서 이미지를 검색 회로 및 네트워크 역학, 전기적 특성, 유체 및 공기 흐름 역학, 그리고 근육의 역학을 포함하여 이들 기관의 측면.

이 문서에서 자세한 표본 준비 프로토콜 및 사후 분석 프로토콜 KESM에 쉽게 액세스하여 결과 데이터를 가지고 외부 연구 그룹을 도울 것으로 예상된다. KESM 작업 프로토콜이 독특한 이미징 양상의 장점과 제한 사항을 감사하기 위해 이러한 외부 연구자 도움이 될 것입니다.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

토드 호프만은 3Scan, KESM 기술 (미국 특허 # 6,744,572)를 제조하고 시장에 상업적인 회사입니다.

Acknowledgements

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이 프로젝트는 NSF (# 0905041, # 0079874), 텍사스 고급 기술 프로그램 (# ATP - 000512-0146 - 2001, # ATP - 000512-0261 - 2001), 텍사스는 (# 1R01 - NS54252) NIH / NINDS에 의해 투자되었다 A & M 학술 진흥 재단, 텍사스 A & M 대학, 3Scan에서 컴퓨터 과학 및 공학과. 우리는 기술 상담 KESM 장비에 대한 지원 버나드 메사 (마이크로 스타 기술)을 감사드립니다. KESM의 설계 및 구현의 주요 부분이 2007 년 사망 브루스 H. 맥코믹에 의해 수행되었다.

References

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