사용자 정의 MicroRNA의 Microarray 실험을 수행

Summary

사용자 정의 microRNA의 microarray 실험을 수행 간단한 절차 설명합니다. 단계, RNA, RNA 라벨링 및 참조 DNA를 분리 microarrays에 샘플을 hybridizing, microarrays를 검색, quantifying 및 하이브리드화 신호를 분석 등이 있습니다.

Abstract

microRNAs는 (miRNAs) 널리 eukaryotes ¹ 표현됩니다 ~ 22 세포핵 (NT) 긴 RNA 분자의 큰 가족입니다. 복잡한 genomes는 주로 사후 transcriptionally 대상 유전자 ^{2, 3의} 방대한 숫자의 표현을 억제 miRNAs 중 적어도 수백, 인코딩. miRNAs는 생물 학적 과정 ¹ 광범위한 제어합니다. 또한, 변경 miRNA 발현이 같은 암 등 인간의 질병와 관련된되었으며, miRNAs는 질병 및 예후 (豫后) ^{4, 5에} 대한 생체 역할을 수 있습니다. 그것은 표현과 여러 가지 조건에서 miRNAs의 기능을 이해하기 위해, 따라서, 중요합니다.

실시간 PCR, microarray, 깊이 시퀀싱 : 세 가지 주요 방법은 프로필 miRNA 발현에 고용되었습니다. miRNA의 microarray의 기술은 일반적으로 저렴 높은 처리량되는 장점을 가지고 있으며, 실험 및 분석 단계의 대부분은 카 수 있습니다대부분의 대학, 의과 대학 및 관련 병원에서 분자 생물학 연구실에서 지휘를 맡는​​. 여기, 우리는 사용자 정의 miRNA의 microarray 실험을 수행하는 방법을 설명합니다. miRNA 프로브 세트는 miRNA의 microarrays를 만들어 유리 슬라이드에 인쇄됩니다. RNA는 작은 RNA 수종을 보존하는 방법이나 시약을 사용하여 절연하고 형광 염료와 함께 표시됩니다. 컨트롤로서, miRNAs의 하위 집합에 해당 참조의 DNA oligonucleotides는 다른 형광 염료로 분류됩니다. 참조 DNA는 슬라이드와 하이브 리다이 제이션의 품질을 증명하기 위해 제공되며, 또한 데이터 정규화에 사용됩니다. RNA와 DNA가 혼합하여 데이터베이스에있는 miRNAs 대부분의 프로브를 포함하는 microarray 슬라이드에 hybridized입니다. 세탁 후, 슬라이드 이미지를 얻기 위해 스캔하고, 개별 명소의 농도는 계량입니다. 이러한 원시 신호는 추가로 처리하고 해당 miRNAs의 표현 데이터로 분석됩니다. Microarray 슬라이드는 옷을 벗긴 채 microarrays의 비용을 절감하고 microarray 실험의 일관성을 향상시키기 위해 생성하실 수 있습니다. 동일한 원칙과 절차를 정의 microarray 실험의 다른 유형에 적용됩니다.

Protocol

1. 사용자 정의 miRNA의 microarrays의 인쇄

1. microarray는 대학이나 회사에서 microarray 핵심 시설 서비스를 이용 슬라이드 인쇄합니다. microarray 제조의 품질은 microarray 실험의 성공을 위해 가장 중요한 요소 중 하나입니다. 가능하면 몇 가지 서비스를보십시오. 이상적으로, 하나는 한 번에 50-100 슬라이드를 인쇄 것이며, 모든 슬라이드가 잘 구분하여, 각각의 장소와 동일 보입니다.
2. microarray 지원, 우리는 격차 II 코팅 슬라이드를 사용합니다.
3. miRNA 프로브 위해, 우리는 NCode 멀티 종 (species)이 Microarray 프로브가 V2 세트 miRNA 사용합니다.
4. 10 μm의 3 X SSC에있는 모든 oligonucleotides를 해산하고 quadruply 슬라이드 그들을 인쇄할 수 있습니다. GAAPS II 슬라이드에 대한 지침에 따라 자외선 조사에 의해 슬라이드를 수정. 인쇄 프로브와 함께 지역과 측면을 표시하는 다이아몬드 펜으로 슬라이드 레이블. 22 스토어 ° C.

2. 샘플 준비

1. 모든 방법또는 시약이 한 그것이 작은 RNAs를 유지로 RNA를 분리하는 데 ....

Discussion

깊은 시퀀싱 기술의 최근 발전에도 불구하고, microarray는 DNA와 RNA의 높은 처리량 분석을위한 가능한 선택 남아있다. 깊은 시퀀싱에 비해 microarray 실험은 저렴하고 있으며, 전형적인 분자 생물학 연구소의 실험과 유연성을 허용하고 시간을 절약할 수 데이터 분석 사내의 대부분을 수행할 수 있습니다. 앞으로, microarrays 가능성이 적합 집중적으로 유전자, 예를 들어 세트를 심문하러 있으며, 전부 또는 게놈 또는 miRNAs의 전사 요소의 일부와 같은 원칙과 여기에 제시 절차는 공부를 지정 microarray 실험에서 사용할 수 있습니다 miRNAs 이외에도 유전자 가족. 물론, microarrays에 대한 주요 단점은 시퀀스 정보는 사전을 사용할 수 있어야합니다 수 있습니다. 얼마나 많은 miRNA 유전자가 불분명하다 있지만 이것은 모델 생물에서 대부분의 단백질 유전자 가족 문제가되지 않습니다. 우리가 사용하고있는 프로브 세트 miRBase ^8을 기반으로 설계되었습니.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
항목	공급 업체	카탈로그 번호	댓글
NCode 멀티 종 Microarray 프로브 세트 V2를 miRNA	Invitrogen	MIRMPS201	miRBase 릴리스 9.0 (2006 년 10 월)에 따라 설계되었습니다. 그것은 1140 ~ 수정되지 않은, 웜, 비행, zebrafish, 마우스, 쥐, 인간 miRNAs을 위해 프로브로 34-44 NT 긴 oligonucleotides, 그리고 snoRNAs 등 내부 통제 프로브의 숫자가 포함되어 있습니다. miRNA 프로브는 따라서 성숙 miRNAs ~ 44 NT의 크기 보완 시퀀스 doublets 있습니다. 분석을 위해 하나가 관심의 특정 게놈 (S)에서 miRNAs에 초점을 맞출 수 있습니다.
Trizol	Invitrogen	15596018	총 RNA 샘플 빠르고 준비하고 수치 쉽고 같은 mRNA 분석과 같은 다운 스트림 애플 리케이션에 적합하지만 우리는 또한 사용, 라벨에 대한 작은 RNA 분획을 농축 있습니다.
T4 RNA Ligase 일	뉴 잉글랜드 Biol복근	M0204L
Ulysis 알렉사 형석 647 핵산 라벨링 키트	Invitrogen	U21660	이 키트 또는 유사한 제품뿐만 아니라 실험적인 RNA 샘플 또는 컨트롤 RNA를 (대신 제어 DNA의) 라벨을 사용하실 수 있습니다.
5' - pCU - DY547 - 3 '	Dharmacon	사용자가 만든	작은 RNA 분획은 비슷하게 내고으로 분류하실 수 있습니다.
CentriSep 열	프린스턴 분판	CS - 901
GAPSII 코팅 슬라이드	코닝	40,004	슬라이드의 다른 유형도 사용할 수 있습니다.
Microarray의 하이브 리다이 제이션 챔버	코닝	2551 또는 40080	하이브 리다이 제이션 실 및 coverslips 다른 종류도 작동합니다. 상용 하이브 리다이 제이션 기계를 사용하면 ~ 2 시간, 크게 예 하이브 리다이 제이션 시간을 줄일 수 있습니다.
Lifterslips	일ermo / 에리 과학	25X60I - M5439 - 001 - LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	애질런트