이 방법은 EpiAirways, 공기 - 액체 인터페이스에서 성장 기본 인간의 호흡기 상피 조직, 생물학 관련 공동 문화 확장 박테리아의 특성을 허용 체외에서 모델입니다. 접근 방식은 공동 문화 장기 의무가있는 모든 미생물과 함께 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
2; Nontypeable 헤모필러스 인플루엔자 (NTHi)는 호흡기 점막 1 반복 및 만성 감염을 일으킬 수 인간 적응 그람 음성 세균 있습니다. 이러한 생물은 호흡 조직 및 내부 생존하는 메커니즘, 박테리아와 인간 세포의 성공적인 장기 협력 문화가 필요합니다 수행할 수있는 모델을 연구한다. 우리는 공기 - 액체 인터페이스에 제기된 주요 인간의 호흡기 상피 조직을 사용 EpiAirway 모델 (MatTek, 애쉬 랜드, MA). 이들은 꽉 분기점, 속눈썹이있는 세포와 nonciliated, mucin를 생산하고, 감염에 대한 응답으로 크린 시토킨를 생산하는 능력을 유지 고블렛 세포를 포함하지 않는 불후의, 잘 차별, 3 차원 조직입니다.
인간 상부기도의 체외 모델에서 본 생물학 관련은 여러 가지 방법으로 사용할 수 있으며이 방법의 전반적인 목표는 시간이 지남에 따라 NTHi과 quantitate와 EpiAirway 조직의 장기 공동 문화 셀 - 관련 및 internalized 박테리아를 수행하는 것입니다 . 뿐만 아니라, 공동 문화 감염의 mucin 생산 및 시토킨 프로필이 결정하실 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 많은 현재의 프로토콜의 기존 방법에 따라 개선 연장 기간 세 이상의 세균 감염을 지원하지 않습니다 인간의 세포의 잠수 monolayer 또는 트랜 스웰 문화를 사용합니다. 유기체가 overlying 미디어에 복제할 수있다면 예를 들어,이 실험을 체포, 세포 독성 및 호스트 세포의 손실 허용되지 않는 수준이 발생할 수 있습니다. EpiAirway 모델은 장기 호스트 병원체 상호 작용의 특성을 허용합니다. EpiAirway에 대한 소스가 오히려 불후의 라인보다 일반적인 인간 tracheo - 기관지 세포이기 때문에 또한, 각 구조와 기능 4 모두 실제 인간의 상부 호흡기 트랙트 조직의 훌륭한 표현이다.
이 방법은 EpiAirway 조직은 이전에 배달 2 일 안티 - 미생물 및 안티 곰팡이 화합물의 젖을에서, 모든 절차는 항생제가없는 조건에서 수행됩니다. 이것은 모두 박테리아와 인간의 기본 조직은 동일한 biosafety 캐비닛에 사용되므로, 특별 고려 사항을 요구하고, 오랜 시간 동안 공동 양식입니다.
프로토콜
1. EpiAirway 조직에 대한 biosafety 캐비닛 준비
- 다시 장갑 묶인 머리, 전용 실험 복을 입고, 층류를 시작합니다. 오분 후, 한쪽으로 캐비닛 (pipettors, 팁, 원심 분리기 튜브 등)에 도구를 이동, 스프레이 70 % 에탄올과 깨끗한 종이 타월로 닦아 아래와 biosafety 캐비닛 내부 및 창틀. 70 % 에탄올로 다시 청소 인테리어 스프레이 건조에 둡니다. 깨끗한쪽으로 도구를 이동하고 에탄올 절차를 반복하십시오.
- 캐비닛의 에어로졸 장벽 피펫 팁 및 전용 pipettors을 사용합니다. 개별 포장된 멸균 serological pipettes를 사용하려면, 폐기 포장 밖을 층류를 통해 연결 끝에 합격 깨면, 그리고 캐비닛에 피펫을 슬라이드.
- EpiAirway 삽입은 무균 포셉으로 취급해야합니다. 플레이스 6 인치 미세 팁 곡선 자체 밀봉 살균 파우치와 압력솥에 집게를 해부. 사용하기 위해 최소한 6 하루 준비가있을 정도로 준비합니다.
2. EpiAirway 조직을 풀고
- 70 % 에탄올로 biosafety 캐비닛에 작업 표면을 스프레이 깨끗한 종이 타월로 아래로 닦으십시오. 다시 스프레이와 표면을 사용하기 전에 건조 수 있습니다....
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토론
이 방법은 허용하는 공기 - 액체 인터페이스에서 기본 인간의 호흡기 조직의 생물학 관련 배경으로 장기 호스트 병원체 상호 작용의 조사. 여기서 우리는 감염 유기체로 NTHi를 사용해야하지만, 시간이 지남에 따라 허용되지 않는 세포 독성을 소개하지 않는 박테리아의 상호 작용이 방법으로 계량하실 수 있습니다. EpiAirway 모델은 또한 바이러스, 약물, 또는 화학 물질에 영향을 인간의 상부기도 5의 연구에 사용될 수 있습니다, 6, 7, 8. 우리는 적어도 10 일간 NTHi에 감염된 40 개 이상의 일, 그리고 조직에 대한 감염되지 않은 조직을 유지했습니다. 우리는 원하는 경우에 감염된 조직이 크게 오래 유지 될 수 있다고 기대합니다.
이 방법의 한계 reconstitute 이러한 조직에서 유능한 면역 체계를 무능력을 포함하여 체외 모델에서, 그 비슷합니다. 조직의 일상적인 세척이이 조직에서 생산되는 mucin의 자연 .......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 도움이 토론 패트릭 헤이든 (MatTek)을 감사하고, 로버트 스미스와 그 EM 기술에 대한 조지아 보건 과학 대학의 리비 페리 것입니다. 이 연구는 아빠 NIDCD 부여 DC010187에 의해 투자되었다
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 # | 댓글 |
| 사포닌 | Calbiochem | 558255 - 25GM | 칼슘이나 마그네슘없이 D - PBS에 1 %, 소독 필터 |
| 1 X Dulbecco의 칼슘, 마그네슘과 생리 인산염은 버퍼 | Lonza | 17 - 513Q | |
| 1 X Dulbecco의 칼슘이나 마그네슘없이 생리 인산염은 버퍼 | Lonza | 17 - 515Q | |
| EpiAirway 항생제없는 조직 | MatTek | AIR - 100 - ABF | |
| EpiAirway 항생제없는 유지 보수 미디어 | MatTek | AIR - 100 - MM - ABF | 키트와 함께 제공된 |
| 10X 인산염 버퍼 생리 식염수 | EMD | 6506 | 1X로 희석 사용하기 전에 |
| 젤라틴 | JT 베이커 | 2124-01 | 1 X PBS 및 압력솥에 0.1 %의 최종 농도에 추가 |
| Difco GC 매체 자료 (초콜릿 한천 배지) | VWR | 90002-016 | 압력솥 36 500 ML ddH 2 O에서 g와 60 쿨 ° C |
| BBL의 혈색소 (초콜릿 한천 배지) | VWR | 90000-662 | 60 쿨 500 ML ddH 2 O에서 압력솥 10g, ° C 이상 GC 매체 기반으로 믹스 |
| BD BBL IsoVitaleX 농축 (초콜릿 한천 배지) | VWR | 90000-414 | ° C와 rehydrated IsoVitaleX 10 ML을 추가, 초콜릿 한천 플레이트를 부어 55 GC 매체 기지와 헤모글로빈의 혼합물을 쿨 |
| 해부 포셉, 좋은 팁이 곡선 | VWR | 82027-406 | |
| 자체 밀봉 살균 파우치 | VWR | 89140-802 | |
| Gentamicin 황산, 10 MG / ML | Lonza | 17 - 519Z | gentamicin 죽이기 위해 EpiAirway의 MM 10 microliters / ML 추가 |
참고문헌
- Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
- Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I.
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