시토크롬를 사용 Mitochondrial 호흡 기능의 시각화 C 데이스 / 호박산 탈수소 효소 (COX / SDH)를 두 번 라벨 Histochemistry

Summary

시토크롬 C 산화 효소 / 나트륨 탈수소 효소 (COX / SDH)를 두 번 라벨링 방법은 신선한 - 냉동 조직 섹션에서 mitochondrial 호흡 효소 결함의 직접적인 시각화를위한 수 있습니다. 이것은 간단한 histochemical 기법입니다 mitochondrial 질병, 노화, 그리고 노화 관련 질환을 조사하는 데 유용합니다.

Abstract

Mitochondrial DNA (mtDNA) 결함이 질병의 중요한 원인이며, 변경의 ^1,2를 노화와 노화 관련 기초 수 있습니다. 노화의 mitochondrial 이론은 노화 ^3, bioenergetics의 항상성 및 세포 기능을 변경할 수 있습니다 mtDNA 변이에 대한 역할을 제안합니다. 증거가 풍부한이 이론 ^1,4, mtDNA mutator 마우스 ^오되는 예제를 지원하도록 컴파일되어 있지만, 노화의 mtDNA 손상의 정확한 역할은 ^6,7 완전히 이해되지 않습니다.

호흡 효소의 활동을 관찰하는 것은 mitochondrial 장애를 조사하는 간단한 방법입니다. 복잡한 IV 또는 시토크롬 C 산화 효소 (COX)는 mitochondrial 기능에 대한 필수적입니다. COX의 촉매 subunits는 mtDNA에 의해 인코딩과 복잡한 조립 (그림 1) 필수입니다. 그러므로, 적절한 합성과 기능을 크게 mtDNA 무결성 ² 기반으로합니다.다른 호흡 단지가 조사 될 수 있지만, 단지 IV와 II는 histochemical 시험 ^8,9 가장 의무가 있습니다. 증가 mitochondrial biogenesis ^10-12을 나타내는 수도 있지만, 복잡한 II, 또는 호박산 탈수소 효소 (SDH)는, 완전히 핵 DNA (그림 1)에 의해 인코딩되어, 그 활동은 일반적으로 장애인 mtDNA에 의해 영향을받지 않습니다. 장애 mtDNA는 노화, mitochondrial 질환에서 관찰하고, 연령 관련 질병은 종종 낮은 값이나 COX 활동 ^2,12-14과 함께 세포의 존재에 이르게한다. COX와 SDH 활동 개별적으로 조사 수 있지만, 순차적 이중 라벨 부착 방법 ^15,16은 mitochondrial 장애 ^12,17-21와 세포를 찾는데 유리한 것으로 입증되었습니다.

분석의 최적의 체질의 대부분은 이러한 기판 농도, 전자 acceptors / 기증자, 중급 전자 통신 사업자, 산도의 영향, 그리고 반응 t으로 결정되었습니다IME ^9,22,23. 3,3 '- diaminobenzidine (DAB)은 효과적이고 신뢰할 수있는 전자 기증자 ^22. COX 기능과 세포에서 갈색 indamine 폴리머 제품은 mitochondrial cristae에 집중하고 세포에게 ²² 포화 것입니다. 장애 COX있는 사람 세포 따라서 파란색 formazan 엔드 제품 ^9,24에 nitroblue tetrazolium (NBT), 전자 수용체의 감소에 의한 SDH 활동의 시각화에 대한 허용, DAB 제품에서 포화되지 않습니다. 시토크롬 C와 나트륨 호박산 기판은 제어와 돌연변이 / 병에 걸린 조직 ^구 사이의 내생적인 수치를 정상화에 추가됩니다. 카탈 라 아제 퍼옥시데이즈 활동 ^9,22에서 가능한 오염 반응을 피하기 위해 예방책으로 추가됩니다. Phenazine의 methosulfate (PMS), 중간 전자 운반체는 최종 반응 제품 ^9,25의 형성을 증가 나트륨 azide, 호흡 사슬 억제제와 함께 사용됩니다. 이 통보에도 불구하고ation,이 알맞은 간단 분석의 결과에 영향을 미치는 몇 가지 중요한 세부 사항은, 특이성 컨트롤과 기술의 진보뿐만 아니라, 아직 제시되지 않았습니다.

Protocol

1. cryosectioning을위한 조직 준비

1. 가능한 윤리적 허가에 따라 자궁 경부 전위 또는 잘린에 의해 동물을 희생.
2. 신속 관심 조직 (예 :. 뇌를) 수집, 그리고 신속하게 드라이 아이스 (조직이 최적의 형태를 얻을 액체 질소로 냉각 이소펜탄 또는 프로판의 동결을 요구할 수 있습니다)에 고정. 섹션 -80시 알루미늄 호일의 상점 조직은 ° C까지 준비.
3. cryosectioning에 대비하여 냉동 조직을 삽입할 수 있습니다.
4. -21에서 14 μm의 그라 이오 스탯 섹션을 모아서 ° C (온도를 조정해야 할 수도 있습니다 ± 1-2 ° C). 사용할 때까지 -20 ° C에서 coverslipping하지 않고 가열 블록 및 저장 슬라이드를 사용하여 슬라이드에 녹여 섹션.

2. COX의 histochemistry

1. 슬라이드는 1 시간 동안 상온에서 건조하도록 허용합니다. 서부 유럽 표준시 필터 종이 슬라이드 얼룩 챔버에 슬라이드를 넣고, 스트립으로 절단. consisten을 얻으려면각 실험에서 t 결과, 그것은 시간 지연을 최소화하기 위해 실험을 한 사람당 10 슬라이드의 최대 처리하는 것이 좋습니다.
2. 화....

Discussion

통합 COX / SDH histochemical 방법은 mitochondrial 장애와 세포의 시각화 수 있습니다. 이 기법은, 초기 연구는 1968까지 거슬러 올라가는와 함께, 많은이에게 환자 ^{14,19,26,27에서} mitochondrial 질병을 식별에 대한 "황금 표준"을 고려와 함께 인기가 남아있다. 그것은 지금 자주 mtDNA 변이 기반 노화와 노화 관련 질환 ^{12,13,18,20,21,24을} 조사하는 데 사용됩니다. COX / SDH 이중 라벨 부착 방법은 종종 특정 mtDNA 변이를 식별하고 더 이상 이러한 oximetric 측정과 분광 효소 분석 ^28,29로 mitochondrial 호흡 효소를 조사하기 위해 다른 기술을 병렬로 사용됩니다.

그 오랜 사용에도 불구하고, 방법을 개선하기 위해 중요한 세부 정보, 간단한 특이성 컨트롤, 그리고 발전은 아직 제시되지 않았습니다. 조직의 취급.......

Materials

시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
드라이 아이스	AGA 가스 AB	블록 형태
이소펜탄 (2 methylbutane)	시그마 - 올드 리치	277,258 CAS : ​​78-78-4
Cyrostat의 삽입 솔루션	사쿠라 Finetek	조직 테크 4583
그라 이오 스탯	Microm	Microm 모델 HM 500 미터
슬라이드	써모 과학	슈퍼 프로스트 플러스 Menzel Gläser J1800AMWZ
커버 안경 Borosilicate 유리	VWR 인터내셔널	16004-098	24 X 50mm
필터 용지	Munktell 필터 AB	품질 : 1350 기사번호 : 242 001	430 X 430mm
3,3 '- diaminobenzidine의 tetrahydrochloride (DAB)	시그마 - 올드 리치	시그마 액체 기판 시스템, D7304
시토크롬 C (유형 III, 말 마음에서)	시그마 - 올드 리치	C2506 CAS : ​​9007-43-6
(간부터) 카탈 라 아제 소	시그마 - 올드 리치	C9322 CAS : ​​9001-05-2
Nitroblue tetrazolium (NBT)	시그마 - 올드 리치	N6876 CAS : ​​298-83-9
나트륨 호박산	시그마 - 올드 리치	S2378 CAS : ​​6106-21-4
Phenazine의 methosulfate (PMS)	시그마 - 올드 리치	P9625 CAS : ​​299-11-6	PMS는 빛을 구분합니다. 빛과 방패.
나트륨 azide	시그마 - 올드 리치	S8032 CAS : ​​26628-22-8
크실렌	VWR 인터내셔널	EM - XX0060 - 4
Entellan	VWR 인터내셔널	100503-870
말로 네이트 (Malonic 산)	시그마 - 올드 리치	M1296 CAS : ​​141-82-2