이 문서는 배아 피부와 thymus 혈관을 라벨에 대한 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
기능성 혈관 네트워크의 설립 organogenesis의 필수적인 부분이며, 최적의 장기의 기능이 필요합니다. 예를 들어, thymus 적절한 vasculature 형성과 patterning에있는 기관 및 주변에 성숙한 T 세포 출구로 thymocyte 입학 필수적입니다. thymus에서 혈관의 공간적 배열은 로컬 microenvironment의 신호, 즉 상피 세포 thymic (TEC)에 의존적일 수 밖에 없습니다. 몇 가지 최근의 보고서는 thymus 혈관 결함 1,2에서 이러한 신호 결과의 중단을 제안한다. 이전 연구는 신생아와 성인의 thymus vasculature 1,2 레이블을하는 데 사용되는 기술을 설명합니다. 우리는 여기서 배아 thymus에서 혈관을 라벨에 대한 기술을 보여줍니다. 이 방법은 FITC - dextran 또는 Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia 렉틴 I (GSL 1 - isolectin B 4)의 사용을 결합한 얼굴 정맥 주사 및 CD31 항체 얼룩 thymus 혈관 구조와 thymic perivascular mesenchyme 3-5 라벨 PDGFR - β를 식별할 수 있습니다. cryosections 또는 vibratome 섹션을 사용할 수있는 옵션도 제공됩니다. 이 프로토콜은 thymus 혈관 형성에 TEC - 파생 분자의 역할을 정의하는 것이 중요합니다 thymus 혈관 결함을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 방법은 전체 vasculature를 레이블로, 그것은 또한 피부와 마음 60-10 포함한 배아에 걸쳐 여러 기관과 조직에 혈관 네트워크를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
프로토콜
1. 플루오레신는 dextran과 GSL I - isolectin B 네 얼굴 정맥 주사가 배아 vasculature를 라벨에 표시
- isolectin B 1.5mL Eppendorf 튜브에 PBS에서 4 (20ug/200uL) 37에 따뜻한 ° C. - 인산에 FITC - dextran (50ug/mL)를 준비 식염수 (PBS) 또는 GSL 1 버퍼 그린 / PBS GSL 1 FITC - dextran 솔루션 (총 볼륨 1mL) 및 주식 1.25mM 빨리 180uL 주식 1.25mM 빠른 그린 / PBS의 100uL 추가 - isolectin 솔루션은되도록 B 4 (총 볼륨 200uL) 눈에 파란색.
- allantoic 스토킹 (제대 동맥과 정맥)은 그대로두고, 함께 E14.5 - E18.5 배아와 난황을 해부하다.
- 새로운 petrie 요리 (60 X 15mm)로 배아를 전송하고 실온에서 PBS에 젖어.
- 머리 / 얼굴의 화살보기를 제공하기 위해 배아를 놓습니다. 부드럽게 머리에있는 배아를 파악하기 위해 마이크로 해부 집게를 사용하십시오.
- 30G 바늘을 사용 50uL FITC - dextran (50ug/mL) 또는 GSL 1 삽입 - isole....
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토론
섹션에서 전체 마운트 및 PECAM - 1 (CD31) 얼룩은 배아 생쥐에서 vasculature을 라벨에 대한 종래의 방법입니다. 이 방법은 직접 및 / 또는 간접 immunofluorescence와 마우스 조직을 permeabilize하기 위해 세제의 사용을 필요로합니다. 이것은 다소 적시에 처리하는 증명한다. 여기, 우리는 FITC - dextran 또는 isolectin B 사 안면 정맥 주사 직접함으로써 항체 라벨 단계에 대한 요구를 제거, 배아 vasculature 레이블을 고용했습니다. '새는'phenotypes이 방법으로하지만 기존의 항체 얼룩 방법으로 공개 될 것이다 또한이 방법은 vasculature의 기능 상태를 평가하실 수 있습니다.
우리는 배아 thymus의 섹션을 분석하고, 마음뿐만 아니라, 곧 얼굴 정맥 주사 후 피부 vasculature 전체 마운트하여이 기술의 효율성을 검증했습니다. 또한, 우리는 CD31 다음 .......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 NIAID에서 NRM 및 JLB에 SREB의 논문의 화목 상을 부여하는 번호 R01AI055001 및 R01AI082127 지원했다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| FITC - dextran | 시그마 | FD150S - 1G | |
| isolectin B 4 - 플루오레신는 GSL 1 분류 | 벡터 연구소 | FL - 1201 | |
| 빠른 그린 | MP의 Biomedicals | 195,178 | |
| PFA | Fluka | 76,240 | |
| 태아 소 혈청 | 애틀랜타 체액 | S11550 | |
| 최적의 절삭 온도 컴파 운드 (OCT | VWR | 25608-930 | |
| 아세톤 | JT 베이커 | 9006-33 | |
| 당나귀 세럼 | 잭슨 | 017-000-121 | |
| 쥐 방지 마우스 CD31, | BD Pharmingen | 558,736 | |
| 염소 안티 마우스 PDGFR - β | R & D 시스템 | AF1042 | |
| 당나귀 안티 쥐 CD31 알렉사 647 (Invitrogen) | Biolegend | 102,516 | |
| 당나귀 안티 염소 알렉사 594 (Invitrogen) | Invitrogen | A11058 | |
| 트리톤 X -100 | 시그마 - 올드 리치 | X - 100 | |
| 낮은 용융 아가로 오스 / PBS | 시그마 - 올드 리치 | A9414 - 25G | |
| 메탄올 | 피셔 과학 | A413 - 4 | |
| 벤질 알코올 | Acros 과학 | 148,390,010 | |
| 벤질 벤조 산 | Acros 과학 | 105,860,010 | |
| 우울증 슬라이드 | 피셔 과학 | S175201 | |
| Fluorogel | 전자 현미경 과학 | 17985-10 | |
| 커버 유리 (22X22) -1.5 | 써모 과학 | 152,222 | |
| 자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 현미경 | 자이스 혈구 | ||
| 마이크로 해부 포셉 | Roboz | RS - 5135 | |
| Parafilm 번호 OM992 | 피셔 과학 | 13-374-16 | |
| 12 24 잘 microplates | 에버그린 과학 | 222-8044 - 01F | |
| Superfrost / 플러스 현미경 슬라이드 | 피셔 과학 | 12-550-15 | |
| 4mL 맑은 튜브 | 국립 과학 | B7800 - 2 |
참고문헌
- Cuddihy, A. R. VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus. Blood. 113, 2723-2731 (2009).
- Muller, S. M. Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ....
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재인쇄 및 허가
