수정 Zigmond 회의소 분석을 사용하여 트렁크 신경 크레스트 세포 마이그레이션 분석

Summary

explanted 전지 (트렁크 신경 크레스트 세포)의 마이그레이션을 분석 접근 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은, 저렴한 부드러운, 그리고 차 트렁크 신경 크레스트 세포 배양에서 세포 세포의 상호 작용에서 파생 된 것과 같은 철새 극성에 모두 chemokinesis 및 기타 영향의 chemotaxis를 구별 할 수 있습니다.

Abstract

신경 크레스트 세포는 (NCCs) 상피 - 중간 엽 전이 ^1,2를 진행 한 후 등쪽의 신경 튜브 (NT)에서 이민을하는 척추 동물의 개발에 존재하는 세포의 과도 인구입니다. 자신의 목표에 도달 할 때까지 EMT 따라 NCCs는 stereotypic 경로를 따라 큰 거리를 마이그레이션. NCCs는 뉴런, glia, melanocytes, 그리고 ^1-3 chromaffin 세포를 포함한 세포 유형의 광대 한 배열로 차별화. 자신의 적절한 타겟 위치에 도달하고 인식 NCCs의 능력 트렁크 구성 요소를 ^세 NCC-파생를 포함하는 모든 구조의 적절한 형성을위한 기초입니다. 트렁크 NCC 마이그레이션에 대한 지침의 메커니즘을 Elucidating하는 것은 큰 의미를 갖는 일이었다. 많은 분자 NCC 마이그레이션 ⁴ 안내하는 입증되었습니다. 예를 들어, 트렁크 NCCs는 이러한 Semaphorin, Ephrin, 그리고 슬릿 리간드 ^5-8 등의 제외지도 단서에 의해 거부 될 것으로 알려져 있습니다. 그러나,하지최근 트렁크 NCCs ⁹ 식별 된 모든 chemoattractants이 때까지.

자기편 세포의 chemotactic 동작을 공부에 체외 접근 방법에서 기존는 불후의, homogenously 배포 세포를 가지고 가장 적합한하지만, 처음 균일 분포를 부족 빠르게 (예 : NCCs 등) 차별화 특정 기본 줄기 세포 문화에 적용 할 더 도전합니다. chemotaxis 연구 트렁크 NCCs의 분포를 균질화하는 한 접근 방식이 기본 NT의 explant 문화에서 트렁크 NCCs를 분리하는 것입니다 다음, 리프트하고는 거의 100 % 합류 할 replate. 그러나,이 도금 방식은 시간과 충분한 세포를 explant 노력의 상당한 양을 필요로 거칠고이며, 생체 조건에서 발견 할 수있는 이종 방식으로 트렁크 NCCs를 배포합니다.

여기, 우리는 requirin없이 트렁크 NCCs의 chemotaxis 및 다른 철새 반응을 평가 할 수 있습니다에서 체외 접근 방식을보고균일 한 세포 분포를 GA. 이 기술은, 기본의 시간 경과 영상을 이용하여 수정 Zigmond 챔버 (표준 Zigmond 챔버가 다른 ¹⁰ 설명) 내부 트렁크 NCCs을 교란되지 않은. 자신의 예측 자연 방향에 수직 인 chemotactant 그라디언트로 문화의 주변에서 트렁크 NCCs를 노출하여 적용 chemotactant 기울기에 의해 유도 철새 극성에 변경이 감지 할 수 있습니다. 이 기술은 저렴 복제 치료를 당 두 개의 NT의 explants의 배양을 필요로, 거친 셀 리프팅 (예 : trypsinization 등) 방지 생체 조건에 유사한 배포판에 트렁크 NCCs을 떠난, explantation과 실험 사이의 시간의 양 다운 컷 (이 가능성이 차별화의 위험을 감소), 그리고 수많은 철새 특성을 시간 경과 평가를 할 수 있습니다.

Protocol

1. 1 일 : coverslips에 밤 문화의 트렁크 신경 튜브의 분리

1. 38 56 H에 대한 여자의 알을 품어 ° C.는 부화에서 알을 제거 다소 70 %의 에탄올과 함께 물을 뿌리 한 후이를 건조 할 수 있습니다. UV-소독 유리 트레이에 열려있는 알을 해봐.
2. 의 난황에서 각 배아를 추출하고 여자는 벨소리의에 배치합니다. 곡선 가위로 그 피 섬 주변의 제 1 절삭하여이 작업을 수행 한 후, 무딘 집게와, 그 extraembryonic 막에 의해 배아를 들고 여자는 벨소리의 솔루션을 포함하는 멸균 플라스틱 페트리 접시에 배치합니다.
3. 초과 extraembryonic 멤브레인을 트리밍뿐만 아니라 텅스텐 바늘 (그림 1)를 사용하여, 두개골 vagal, 그리고 성례의 축 수준의 각 배아의 줄기를 분리합니다. 첫째, 단계 HH15-17 ¹¹ 사이에 구에 대한 배아를 선택합니다. 최대 단계 HH15와 들어, forebrain 및 hindbrain 축이 예각을 형성하고 따라서 머리 caudally 기울 나타납니다. 에무대 HH17는 꼬리 꽃 봉오리는 현재이며, 틸트 ventrally했지만 아직 somites 포함되어 있지 않습니다. 텅스텐 바늘로 배에서 약 2 mm로 extraembryonic 멤브레인을 트림과 10 체절에 ....

Discussion

트렁크 NCCs에 chemotaxis 조사를 실시하는 것은 이유 시리즈 도전 입증되었습니다. 따라서 트렁크 NCCs은 트렁크 수준 NT의 주 explantation에서 구할 수해야하며 간선 NCCs는 교양 장기 경우 차별화 이기종 줄기 세포 인구를 구성합니다. 체외에서 homogenously 배포 세포 인구의 chemotactic 응답을 공부하는 종래의 방법은 먼저 세포가 고립과 chemotaxis 챔버 (예를 들어, Boyden 챔버 ^12)의 replated homogenously 아르해야하기 때문에 트렁크 NCCs에서 테스트하기가 어렵습니다. 국세청 수십 explantation은 단 한 실험에 대한 충분한 트렁크 NCCs의 균일 한 분포를 생성해야 할 수 있으므로 충분한 NCCs을 분리하는 것은 지루한 수 있습니다. 또한, NCCs는 해제되지 혼합하고, homogenously 자연 맥락에서 재배포 않습니다. 따라서, 특정 종래의 chemotaxis의 assays을 수행하기 위해 repla.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
DMEM	오메가 과학	DM-22
페니실린의 스트렙토 마이신 솔루션	오메가 과학	PS-20	100X 주식 농도
L-글루타민	오메가 과학	GS-60	100X 주식 농도
태아 소 혈청	오메가 과학	FB-11	롯 # 105247 (또는 비교가 또)
수정 Zigmond 챔버	홈 만든	N / A	저수지 볼륨 : ~ 160 μl EA, 추가 사양, 그림을 참조하십시오. 4 보충 제조 프로토콜
세포 배양 접시	Denville	T6040	40 X 10mm
Fibronectin	BD	354008	10X 증권은 1 ML H 2 O 9 ML DMEM에 1 밀리그램 FN을 diluting하여 준비
Coverslips	어부	12-548-B	Precleaned, 22 X 22mm
L15 매체	열 과학	SH30525.02
석유 젤리	불우	011110794642	백퍼센트
원심 분리기 관	Biologix	10-9152	15 ML
Dispase	전지 시스템	4Z0-850	10X 주식 농도
주사기	BD	309602	한 ML
바늘	BD	305127	25 G X 1.5 인치
알렉사 형석 488-IgM	나는nvitrogen	A21042	주식은 2 밀리그램 / ML이다; 7 첩자 염료 / 사마귀 IgM
해부 집게	FST	기타.	뒤몽 # 5 또는 55, 직선 날붙이, 스테인리스 스틸 또는 티타늄
텅스텐 니들	N / A	N / A	집에서 만든, 핀 홀더에 배치
부근 집게	Tiemann	160-18	계란 노른자에서 벨소리 집으로 배아를 전송하는 데 사용