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방법 논문

Mycobacteria의 가능성을 측정하는 기능 전체 혈액 분석은 리포터 - 진 BCG 또는 M. TB (BCG 태그 사용 럭스 / M. TB 럭스)

13.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/3332

⸱

2011년 9월 14일

 ,  , 
1Department of Paediatrics, Imperial College London , 2Centre for Health Sciences, Barts & The London School of Medicine and Dentistry

이 논문에서

요약

우리는 mycobacteria의 열거에 대한 대안적인 접근 방식을 설명 체외에서는 대신 식민지 - 형성 단위 (CFU)의 mycobacteria 태그. 생물의 "생존"뿐만 아니라 호스트 반응 마커가 결핵의 맥락에서 호스트 / 병원체 상호 작용 연구를위한 저비용, 다목적 및 기능 시스템을 제공하는 동시에 측정됩니다.

초록

기능성 assays 오래 주어진 백신 immunogenicity의 측정에 중요한 역할을했습니다. 이것은 통상 혈청 bactericidal titers으로 표시됩니다. 어린 시절 백신에 대한 응답으로 혈청 bactericidal titers의 연구는 일상적인 사용에 우리가 보호 면역 반응과 같은 컷 오프에 대한 수준을 개발하고 차단 확인할 수있게했습니다. 그런 assays는 그러한 TB 백신으로 효과기 T 세포 응답의 형태로 주로 세포 매개 면역을 유발 백신의 일상적인 평가에 앞으로 이동되지 않았습니다. 동물 모델에서 특정 백신 후보의 성능은 정기적으로 표준 bactericidal assays에서 평가되며, 현재의 모든 소설 TB - 백신 후보는 1 인체에 실험을 위상하기 전에 자신의 평가에서이 단계를 받게되었습니다. immunogenicity 따라서 소설 안티 - TB 백신의 보호 효능 가능성의 평가는 이상적으로 bactericidal assays의 측정을 포함하여, 지금은 인간의 모델과 유사한 단계 현명한 평가를 받아야한다.

그들이 잠재적으로 유망한 백신 후보를 화면에 적용할 어디 결핵 백신 연구의 맥락에서 Bactericidal assays은 이미 잘, 동물 모델에 설립되었습니다. immunogenicity의 읽기 밖의 주요 등 다양한 장기의 기능에 세균 부하 감소. 그러나, 그러한 assays 데이트 소설 안티 - 결핵 백신에 대한 임상 실험에 포함되지 않았습니다.

인간의 macrophages 내부 mycobacteria의 살인으로 이어지는 정확한 메커니즘에 대한 불확실성이 여전히 있지만, mycobacteria과 macrophages 및 T 세포의 상호 작용은 명확하게 필요합니다. 이 문서에서 설명하는 분석들은 상대적으로 개인의 기여에 대한 가정을하지 않고 전체 피에 다른 모든 세포와 체액성 요소와 같은 주요 세포 구성 요소의 연구를 가능하게 bactericidal assays의 소설 세대를 나타냅니다. 우리의 그룹에 의해 설명하는 분석은 전체 혈액의 작은 볼륨을 사용하여 이미 TB - 지방병 설정에서 성인과 어린이의 연구에 채용되었습니다. 우리는 BCG 백신의 immunogenicity를 볼 HIV 양성 환자에서 mycobacteria의 성장뿐만 아니라 체외에서 mycobacterial 생존에 방지 retroviral 요법과 비타민 D의 효과를 증가하고있다. 여기서 우리는 방법론을 요약하고이 비교적 간단하고 저렴한 비용 및 현장 친화적인 모델을 사용하여 우리의 재현성 데이터를 제시한다.

참고 : 정의 / 약어

BCG 럭스 = M. bovis BCG, 몬트리올 변형은 mycobacterial GroEL (hsp60) 발기인의 통제하에, 장염 harveyi에서 luxAB 유전자를 나르는 셔틀 플라스미드 pSMT1로 바꾸었다.
CFU =의 콜로니 형성 단위 (mycobacterial 생존의 측정).

프로토콜

1. BCG 럭스 기자 mycobacteria 재고 준비

  1. BCG 성장 럭스 미들 7H9 국물이 0.2 % 글리세롤, 0.05 % 십대 초반 80와 10 %의 ADC 농축을 포함하는 중간에 로그 단계로 200rpm에서 잡고 (셔틀 플라스미드 pSMT1로 변환 M. bovis BCG 몬트리올 변형).
  2. 중복에 luminometer 튜브 (900μl PBS + 100μl BCG 룩스 문화)에서 멸균 PBS에서 BCG 럭스 문화의 1시 10분 희석의 1ml를 준비합니다.
  3. 컴퓨터의 뒷면에 N - decyl 알데히드 (루시페라제 효소 기판)이있는 튜브를로드하고 뚜껑이 자리에 안전하고 튜브 있는지 확인하십시오.
  4. luminometer에 배치 3 빈 마중물 튜브의 각으로 100 ucl X 3 주입으로 설정 주요 프로그램을 통해 기판과 수상 luminometer 주입기.
  5. luminometer로 2 튜브를로드하고 각 튜브에 기판의 100 ucl을 주입에서 설정 프로그램을 통해 신호를 1 초 간격 20 초위한 읽어보십시오.
  6. 주식 1x10 8 RLU / ML에 2x10 8 RLU / ML을 (이것은 성장의 3~4일에 대한 소요)에 도달되면, 50ml 팔콘 튜브의 문화 멸균 30 % 글리세롤의 동일한 볼륨을 추가하고 부드럽게 섞는다.
  7. -80에서 레이블 2ml 나사 캡 microtube하고 저장 ° C.으로 나누어지는 1.5ml 볼륨을

2. 결정 재고 RLU / CFU 상관 관계 및 aliquots의 내용

  1. 통풍 모자와 200ml Erlenmeyer 플라스크 10 % ADC의 보완과 함께 미들 7H9 문화 매체 15ml를 추가합니다.
  2. 20 %의 십대 초반의 hygromycin와 30μl의 15μl를 추가합니다.
  3. 안전 캐비닛에 실내 온도 (RT)에서 냉동고와 서리를 없애다에서 BCG 럭스의 병을 제거합니다. 매체에 유리병의 내용을 추가하고 뚜껑을 조입니다.
  4. 37 200rpm에서 흔들어 ° C를 4 일간 함​​께 품어.
  5. 매일, CFU 결정을위한 일련 10 배 dilutions을 (1시 10분, 1:100, 1:1000, 1:10,000과 1:100,000)까지합니다.
  6. 병렬 같은 dilutions을 설정하고 (일부 1.2-1.6 참조) 발광을 결정하기 위해 중복.
  7. 미들 7H11 한천 배지 (0.5 % 글리세롤 10 % OADC 보완, 20 % 십대 초반과 hygromycin 1 ML 1 ML을 포함하는 액체 매질 1 L)의 두 3 구획 접시를 준비합니다.
  8. 각 챔버에 걸쳐 균등하게 액체를 배포 별도 밧침대를 사용하여 각 접시의 세그먼트에 각 희석의 100μl, 나가 플레이트.
  9. parafilm 각 접시, 멸균 플라스틱 봉투에 장소, 압력솥 테이프와 인감 도장, 37에서 품어 ° C를 2 주 동안 다운 향하게 뚜껑과 함께.
  10. CFUs이 (2-3 주) 나타날 때까지 정기적으로 검사합니다.
  11. 식민지를 계산하려면, 보육과 식민지 카운터에 장소에서 접시를 제거합니다. 중복 접시에서 각 희석에 대한 의미를 계산합니다.
  12. 각각의 희석에 대한 동등한 RLU 및 CFU 카운트를 사용하여 RLU / CFU 비율을 계산합니다. 비율은 3과 5 RLU / CFU 사이 여야합니다.

3. 전체 혈액에 대한 BCG 접종 럭스 문화의 준비

  1. 통풍 모자와 200ml Erlenmeyer 플라스크 10 % ADC의 보완과 함께 미들 7H9 문화 매체 15ml를 추가합니다.
  2. 20 %의 십대 초반의 hygromycin와 30μl의 15μl를 추가합니다.
  3. 안전 캐비닛에 RT에서 냉장고와 서리를 없애다에서 BCG 럭스의 병을 제거합니다. 매체에 유리병의 내용을 추가하고 뚜껑을 조입니다.
  4. 37 200rpm에서 흔들어 ° C를 2-4일 위해 함께 품어.
  5. 중복에 luminometer 튜브 (900μl PBS + 100μl BCG 룩스 문화)에서 멸균 PBS에서 BCG 럭스 문화의 1시 10분 희석의 1ml를 준비합니다.
  6. 기판과 프라임 luminometer (위에서 설명한 것처럼), 부드럽게 2 튜브 소용돌이와 luminometer로로드하고 판독을 (위에서 설명한 것처럼) 가져가라.
  7. 7x10 6 RLU의 등가를 (이것은의 단핵구 수를 가정, 1시 1분 약 monocytes에 2x10 약 5 CFU / ML 혈액과 BCG의 비율 inoculum를 제공합니다 제공하는 PBS의 문화를 희석이 읽기를 사용하여 혈액 ML 당 4x10 5 2x10 약 5 monocytes).

4. 전체 혈액의 준비

  1. 방부제없는 헤파린이 들어있는 튜브에 정맥 혈액 5ml 3을 가져가라.
  2. 50ml 팔콘 튜브에 혈액을 전송 및 글루타민과 25mM HEPES를 (없음 펜 / strep)이 포함된 RPMI 1640의 동일한 볼륨 희석.
  3. . 0hrs 3과 96hrs 3 필요한 경우, 추가 timepoints에 대한 추가 튜브를 설정합니다. 때마다 포인트 살균 보석 튜브 (총 6 튜브에 세중의에 희석 혈액 나누어지는의 900μl
  4. 에서 10 % ADC 보충 + 50μg/ml hygromycin (BCG 럭스 문화 사용된 같은 ​​매체)와 미들 브룩 7H9 문화 매체 나누어지는에 900μl의 성장 제어를위한 중복.
  5. 혈액의 각 튜브에 희석 BCG 럭스의 100μl를 추가하고 2 성장 제어튜브.
  6. 잘 믹스 37의 락을 인큐베이터에서 쪽에서 시간 - 포인트 96hr과 2 성장 컨트롤 3 bijous을 배치 ° C, 20 레브 / 분 (CO 2는 필요하지 않습니다.)

5. 측정 발광 (0hr 및 96hrs에서)

  1. 10 분 2,000그램에서 3 bijous을 원심 분리기.
  2. 조심스럽게 -80시 동결에 2ml 나사 캡 microtubes의 펠렛과 장소를 방해하지 않고 뜨는의 300μl 제거 ° C 후속 시토킨 분석.
  3. 삭제 뜨는의 볼륨을 교체하기 위해 각 보석에 PBS의 300μl를 추가합니다.
  4. 해당 50ml 팔콘 튜브에 각 보석의 내용을 대기음 각 튜브에 8ml 증류수를 추가합니다. 10 분 타이머를 시작합니다.
    주의 사항 : 이것은 시간에 민감한 단계이며,이 부화는 세포가 먼저 물과 접촉했을 때부터 시작, 더 이상보다 10 분해서는 안됩니다.
  5. 해당 팔콘 튜브에 팁 전에 5 초 동안 증류수와 소용돌이 2ml 각 보석을 씻어.
  6. 10 분 부화 끝에, 10 분 동안 2천그램에서 팔콘 튜브를 원심 분리기.
  7. Surfanios의 살균제에 가만히 따르다에 뜨는.
  8. 각 펠렛과 와동에 몇 유리 구슬을 추가합니다.
  9. 각각의 튜브와 와동에 멸균 PBS의 1ml을 추가합니다.
  10. luminometer 튜브에서 PBS (PBS 900μl가 + 100μl 샘플)와 중복의 시간과 포인트 96hr 각 샘플에 대한 1시 10분 dilutions합니다. 성장 컨트롤 각각에 대해 동일한 dilutions하십시오.
  11. 부드럽게 튜브 소용돌이와 luminometer로로드하고 판독을 (위에서 설명한 것처럼) 걸릴
    주의 : 동일한 샘플 triplicates 사이의 수치가 서로의 15 % 이내에 있어야합니다.

6. 대표 결과 :

그것은 대사 활동이 suboptimal 한, 즉 이전에 샘플을 inoculating하는 48-72시간 이상 성장, 전체 혈액 럭스 assays를위한 성장 단계에 로그 박테리아를 사용하는 것이 중요합니다 냉동고의 직선 밖으로 하나 경우 또는 고정 단계 인치 이전 성장 다양성을 피하기 위해 48 또는 72시간 중 하나에 일련의 실험을 위해 표준화되어야합니다. 그림 1은 BCG 럭스의 대표 문화의 성장 곡선을 보여줍니다. 고정 단계에 도달할 때까지 두 배로 시간은 24 시간 정도입니다.

그림 1
BCG의 그림 1. 대표 성장 곡선 럭스 7H9 매체와 RLU와 CFU의 상관 관계에 96시간 이상.

RLU 값이 항상 CFU와 연관 있지만, 하나의 CFU에 해당 RLU의 숫자는 감염의 일관된 다중성을 보장하기 위해 일련의 실험을 통해 같은 냉동 주식을 사용하는 것이 좋습니다 이유있는가 (즉, 주식에 따라 달라질 수 입니다만).

표 1은 접종 시간 (T 0)에서, 96시간에서 원료 날짜의 예를 보여줍니다. 성장 비율은 공식 T 96 / T 0을 사용하여 계산하지만, 다른 시간 간격은 물론도 측정할 수 있습니다. 중요한 세포 사망이 발생하는대로이 단, 권장, 96시간 넘어 문화를 사용하지 않습니다.

표 1
표 1. 접종 (T0)의 시간과 96시간 (T96) 3 성인 기증자로부터 계산의 성장 비율에 원시 데이터의 예.

사용할 수있는 항원 - 특정 메모리 반응과 가능성 또한 호중구 카운트에 따라 성장 비율과 함께 아이들의 혈액에서 그림 2와 HIV 감염없이 여기 그림과 같이, 개인 간의 차이가 있습니다. 평균, 어린 아이들이 성인보다 높은 성장 비율을 가지고, 투베르쿨린 피부 반응 검사 (TST) +했습니다 개인이 TST - 봤어요 개인보다 낮은 성장 비율을 갖고 있으며 HIV에 감염된 환자는 CD4 T 세포 인구의 결핍으로 인해 성장 비율을 가지고 mycobacteria에 세포 면역 반응의 핵심 중재자 중 하나.

그림 2
그림 2 인터 기증자 다양성 :. 기본 HIV 상태에 따라 환자의 집합에 대한 T 0 대 96시간의 성장 비율.

일정 기간 동안 성장 비율의 재현성은 12 개월 이상 단일 기증자 제어 실험 반복 출혈에서 출혈이 64 회 기증자의 결과를 요약한 그림 3에 표시됩니다. 다양성의 잠재적인 원인은 많은 bioassays에서 관찰 호스트 크린 시토킨의 수준 이내 mycobacterial sensitization이나 다양성의 변화 수 있습니다.

그림 3
그림 3. 12 개월 동안 12 차례에 (A) 단일 기증자. 12m 이상의 두 경우에 (B) 복합 (64) 기증자onths.

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토론

그들이 잠재적으로 유망한 백신 후보를 화면에 적용할 어디 결핵 백신 연구의 맥락에서 Bactericidal assays 잘, 동물 모델에 설립되었습니다. immunogenicity의 읽기 밖의 주요 등 다양한 장기의 기능에 세균 부하 감소.

인간 bactericidal assays의 첫 번째 세대 M. 감염, 혼자 macrophages을 사용하여 설계되었다 결핵. CFU 3 주 최소 시간이 지나면 mycobacterial 생존의 읽기 밖의 주요 역임 하였다. 이러한 assays은 주어진 시간 지점 1,2에 PBMC, 자기편 monocytes / macrophages 및 용해의 준비에 의존.

macrophages 및 M.를 포함하는 T 세포 사이의 좀 더 복잡한 상호 작용에 대한 우리의 이해로서 결핵이 진화하고, 자기 구슬을 사용하여 여러 가지...

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공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

이 작품은 Wellcome 트러스트에서 비테 Kampmann (056608, GRO77273) 개인 장학금에 의해 투자되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약 회사 고양이 없음
BCG 럭스 여러 N / A
미들 7H11 한천 Becton 디킨슨 283810
미들 7H9 국물 BD Biosciences 271310 (500g)
미들 ADC의 농축 BD Biosciences 212352
미들 OADC 보충 Becton 디킨슨 212240
십대 초반 80 시그마 알드리치 274364
글리세린 시그마 알드리치 G5150
Hygromycin B 호슈 10843555001 (20ml)
N - decyl의 알데히드 시그마 D7384 - 100G
에탄올 (> 99.7 %) VWR 101077
멸균 PBS 집에서 N / A
L - 글루타민, 25mM HEPES와 RPMI - 1640 시그마 R0883
멸균 증류수 집에서 N / A
장비
튜브 luminometer (주사용 포트 필수) Berthold AutoLumat LB953 또는 단일 튜브 luminometer 시리우스
Luminometer 튜브, 12 X 75mm, pyrex 무테 VWR의 코닝 99445-12
통풍 모자와 Erlenmeyer flasks의, 멸균 폴리 카보 네이트 250ml 코닝 통해 피셔 과학 2,150,329
BD Vacutainer 혈액 수집 튜브 (방부제없는 헤파린) BD 367676
50ml 팔콘 튜브, 원뿔 BD 352077
7ml Sterilin 표본 폴리 프로필렌 보석 튜브 VWR 99445-12
Sterilin 유니버설 용기 (30 ML) 실험실 분석 LTD 128C
유리 비즈 2mm 직경 SigmaAldrich Z143928
10ml pipettes 및 피펫 소년 어떤
1000μl와 200μl pipettes 및 필터 팁 어떤
일반 실험실 장비 :
클래스 II 안전 캐비닛 캐비닛
냉장고 (4 ° C)
원심 분리기
튜브를 섞어 신나게 흔드는 플랫폼 (180 0)
궤도 흔드는 인큐베이터는 박테리아 문화를 성장을위한 37 ° C에서 설정

참고문헌

  1. Cheng, S. H., Walker, L. Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children. Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).
  2. Cheng, S. H., Walker, K. B. Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom. Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).
  3. Silver, R. F., Li, Q. Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions. Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).
  4. Hoft, D. F., Worku, S. Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity. J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).
  5. Worku, S., Hoft, D. F. Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth. Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).
  6. Kampmann, B., Gaora, P. O. Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria. J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).
  7. Cheon, S. H., Kampmann, B. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).
  8. Janulionis, E., Sofer, C. Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture. Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).
  9. Kampmann, B., Tena, G. N. Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines. Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).
  10. Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART. Aids. 20, 1011-1018 Forthcoming.
  11. Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria. Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).

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