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Summary

Parasitoid (기생) 말벌을 포함한 여러 곤충들의 천적의 주요 클래스를 구성<em> Drosophila melanogaster</em>. 우리는 이러한 기생충을 전파하는 기법을 소개합니다<em> Drosophila</em> SPP. 과 면역 조직에 미치는 영향을 분석하는 방법을 보여줍니다<em> Drosophila</em> 애벌레.

Abstract

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts’ immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.

The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.

Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a “generalist,” which means that it can utilize most Drosophila species as hosts¹. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response². Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited¹. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles³ although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster¹. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster¹ as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.

In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms^1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.

Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)⁴. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)^5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).

We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Spätzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

Protocol

실험에 대한 전체 프로토콜은 네 단계 (그림 9)으로 나누어져 있습니다. 파리 유충에 (1) Culturing의 말벌 (2) 감염을 설정 및 해부를 위해 동물을 준비 (3) 분리 및 호스트 / 기생충 구조를 고치고, (4) 면역 조직 분석.

1. Drosophila의 애벌레에 Culturing의 말벌

말벌 문화의 유지 보수 신중한 계획이 필요합니다. 성장하는 파리에 대한 상대, 그것은 상당히 노동 집중이다. 우리는 24 ° C.에 Drosophila의 yw 변형의 유충이나 pupae의 실험실에있는 말벌의 식민지를 유지 Culturing의 말벌은 올바른 단계에서 호스트의 지속적인 소스를 유지 말벌보다 먼저 등장 파리의 "감염된"튜브를 청소하는 것입니다. 말벌은 성 결정 haplodiploid 방법을 따라하고 그들이 호스트를 감염하기 전에 여성이 성관계를하는 것이 중요합니다.

1. 제 1 일에서 갓 미리의 작은 소량을 추가앞에 서 효모 붙여넣기 (신선한 플라이 식품 유리병에 활성 건조 효모의 약 1g에 물 1 ML을 혼합하여 만든 플라이 음식의 조리법은 중요하지 않으며. 우리 corn-meal/sucrose/agar 매체에 파리를 성장. 장소 50-60 젊은 (2-4일 된) 성인 yw (또는 기타 본질적으로 야생 형 변종)는 24 ° C.에 48 시간 동안 알을 날아
2. 3 일에서 튜브에서 파리를 제거합니다. 버즈 플러그의 내부 측면에 꿀 한 방울로 유리병에 버즈 플러그를 놓습니다. 벌꿀은 증류수에 2시 1분을 희석된다.
3. CO _2를 사용하여 말벌를 마취하고 6-8 여성과 약 2-3일 된 것 6-8 남성을 정렬합니다. 0-48시간 오래된 호스트를 포함하는 유리병에 추가합니다. 말벌은 파리보다 _2를 공동 더 민감합니다, 그리고 가스에 대한 그들의 노출을 보정해야 할 수 있습니다. Drosophila의 연구자들은 표준 Drosophila의 마취 역 설계를 사용하지 마십시오. 말벌를 마취하는 좋은 출발점은 CO ₂ 압력을 설정하는 것입니다anesthetizing 파리에 필요한인지의 약 절반.
4. 유리병에 버즈 플러그 (꿀)을 교체합니다. 말벌이 깨어 날때까지 부드럽게 그 측면에 병을 놓습니다.
5. 24 ° C 배양기에서 파리 유충과 말벌과 함께 이러한 튜브를 놓습니다.
6. 성공적인 감염이 약간 pupariation 지연됩니다. 말벌의 공격을 입었지만 (또는 그들이 감염되지 않은 경우) 자신을 방어할 수 있습니다 않은 호스트는 정상적인 일정과 파리 성충 잘 앞서 말벌의이 번데기에서 등장에 따라 개발을 진행합니다.
7. 25-30일에 말벌 종 및 온도, 말벌 eclose에 따라.
8. 말벌이 개발되는 유리병에서 파리 성충을 제거합니다.

2. 감염을 설정 및 해부를 위해 감염된 동물을 준비

당신이 시작하기 전에 깨끗한 유리 또는 플라스틱 배양 접시, 9 우울증, Kimwipes, 증류수 (물총 병)을 가진 Pyrex 해부 접시 몇가70 % 에탄올 (물총 병에서), 1X PBS (물총 병)를, 현미경 슬라이드 및 편리한 작고 깨끗한 주걱.

1. 감염을 설정하려면 위의 단계 1-5 따릅니다. 실험에 따라서는 개발 대략 동일한 단계에서있는 호스트를 사용해야 할 수도 있습니다. 이를 위해, 2-6 시간의 egglays은 감염에 사용될 수 있습니다.
2. 감염된 유충을 (면역 조직이나 기생충 절개)를 수확하기 위해 작은 유리 또는 플라스틱 배양 접시에 플라이 튜브의 내용을 제거합니다.
3. 신중 6-10 애벌레, 하나씩을 선택하고 1X PBS 먼저 잘 우울증에 그들을 배치, stereomicroscope 훌륭한 포셉 (핀셋)를 사용 후 물로 그들을 전송, 70 % 에탄올, 물, 그리고 1X PBS, 연속. 이 단계의 목적은 플라이 음식 동물을 해방시키고 철저하게 자신의 표면을 청소하고 소독하는 것입니다. 물에 씻어도 에탄올을 dilutes하고 PBS는 에탄올을 제거에서 결승전 린스. 아래 3 단계의 경우, 그것은 모두 잊어버리는 없습니다십분 이상을위한 PBS의 동물.

3. 호스트 / 기생충 구조물을 분리하고 고정

배경

애벌레 림프 글랜드는 작은 조혈 장기 ^7입니다. 세 번째 애벌레 instar에서 림프 글랜드는 앞쪽에 엽 (叶)의 큰 쌍을 포함하는 측면 지느러미 그릇 (그림 3A, 6B-C, 7A-D).에게 앞부분 엽 (叶)은 더욱 독특한 셀 속성 ^7과 전문 영역으로 나누어집니다. 셋 셀 유형, plasmatocytes, lamellocytes, 그리고 크리스탈 세포 Progenitors는 앞쪽에 엽 (叶)에 거주. Pericardial 세포는 작은 후부 엽 (叶)의 앞부분 엽 (叶)을 구분합니다. Drosophila의 림프 글랜드는 곤충과 포유류의 조혈 ^8,9를위한 모델입니다.

뚱땡이 시체는 포유류의 간장에 기능적으로 유사하다. 체액성 반응은 지방이 몸 아래의 미생물이나 말벌 감염 ^1,4,10에서 실행됩니다. 으로결과는, 항균 펩타이드 유전자의 고유한 조합이 활성화되고 펩티드는 hemolymph ^하나에 숨겨진다. 뚱뚱한 몸 또한 글리코겐과 트리 글리세 라이드 생산과 저장 ¹¹ 일차 조직입니다. 애벌레 지방 몸은 hemocoel의 상당한 볼륨을 점유하고 있으므로 림프 글랜드 달리 찾을 수 쉽습니다. 우리는 지금 셋째 instar의 유충으로부터 림프 글랜드 및 지방 시체를 해부하는 방법을 보여줍니다 것입니다.

당신이 시작하기 전에

미세 포셉 (핀셋)과 에탄올 세척 현미경 슬라이드가 필요합니다.

애벌레 림프의 글랜드 해부

1. 미세 집게를 사용하여, 1X PBS에 보관 방황 셋째 instar의 유충을 선택합니다.
2. 현미경 슬라이드를 향해 애벌레를 놓습니다.
3. 집게를 사용하여 최대 복부 측면과 함께 동물을 배치.
4. 이쌍 포셉의를 사용하거나 사후 끝 쪽 (화살촉 1, 그림. 3A)와 g에서 동물을 보유ently 표피에있는 작은, 천박한 눈물을 소개 표피를 당겨.
5. hemocytes, 창자, 그리고 지방 몸을 포함하는 hemolymph는 뱃속에서 탈출하기 시작합니다. hemolymph이 필요한 경우, 얼룩을 만들기 위해 10 μl "pipetteman"함께 촬영 할 수 있습니다.
6. 입 후크 (화살촉 2, 그림. 3A) 아래 동물의 오른쪽에 두 포셉를 게재하면, 부드럽게 표피 찢어.
7. 입 후크 (화살촉 2, 그림. 3A) 아래 동물의 왼쪽으로 두 포셉 이동을 조심스럽게 또 다른 작은 균열을합니다.
8. 입을를 개최하는 것은 동물 사귀는 동안 부드럽게 동물의 뒷부분 끝 (다시 필링하지만 같은)으로 표피를 당겨.
9. 표피가 뒤로 당겨로서, 뇌, 지방 몸, imaginal 디스크, 침샘 및 proventriculus가 노출 될 것이다. 단독 표피는 후부 끝에 지금이지만 여전히 붙어 림프 글랜드와 지느러미 선박됩니다. </ 리>
10. proventriculus 잘라 림프 글랜드 지역에서 멀리 이동합니다. 림프의 글랜드 당신이 그것을 볼 수 없을 경우에도 뇌 밑에 될 것입니다.
11. 조심스럽게 뚱뚱한 몸, 창자, 침샘 및 글랜드에 앉아있을 수있는 다른 구조를 떨어져 애타게. 뇌로 후부에 위치한 고리 글랜드 및 지느러미 선박으로부터 림프 글랜드를 분리하지 않도록주의하십시오. 림프의 글랜드는 현미경 슬라이드에 대한 평면 배치됩니다.
12. 전체 글랜드가 앞쪽에 엽 (叶)에서 pericardial 세포의 최종 세트에 펼쳐져 때까지 조심스럽게 림프 글랜드에서 떨어져 모든 추가 조직을 제거합니다.

참고 : 제대로 해부하는 림프 글랜드는 앞쪽에 엽 (叶) 및 등 부분의 혈관을 따라 사후 엽 (叶) (그림 6B) 두 가지 중 하나를 갖고 있습니다. 돌출부가 쉽게 손상될 수 또는 지느러미 혈관에서 떨어져 있습니다. 샘플 따라서 매우 세심하게 다루어 져야합니다. 또한 글랜드 H주름이나 계약 경향이 있습니다. 부드럽게 그 후부 끝에 오르간을 교정하는 것은 모든 부품과 전지가 잘 제시하기 위해 수 있습니다. 이것은 immunostaining 프로토콜에 특히 필요하다.

페이의 신체 해부

1. 자이스 혈구 1000 해부 현미경 (현미경을 해부하는 입체 음향을 사용할 수있다)의 해부 무대에서 입사 광이 예제를 통해 전송될 수있는 가벼운 상자를 놓습니다. 1X PBS 200 μl의 현미경 슬라이드에 2 단계에서 삼분의 일 instar의 애벌레를 둡니다. 유기체가 투명 나타나고 따라서는 내부 장기를 시각화하기 쉽고 있도록 시료에서 떨어져 광원을 기울이십시오.
2. 앞부분은 끝까지 널 멀리로부터 있도록 포셉, 위치에게 동물을 사용합니다.
3. 집게를 사용하여 자사의 입을 후크의 왼쪽 (화살촉 1, 그림. 3B)에서 유충의 표피를 개최. 다른 포셉 사용하여 부드럽게 표피에게 후부 끝까지 (AR을 찢다rowhead 2, 그림 3B). 후부 끝에 신체에서 떨어져 표피를 찢어하지 마십시오.
4. 아주 부드럽게 한쪽으로 창자를 제거 시작합니다.
5. 부드럽게 뇌, imaginal 디스크 및 링 선 등의 선박 흐르는 림프 글랜드과를 제거합니다.
6. 이러한 땀샘을 지키는 지방이 신체가 있으므로 침샘을 제거하지 마십시오.
7. 부드럽게 표피를 제거하고 1X PBS에서 슬라이드에 지방이 몸 둡니다.

주 1 : 지방이 신체가 하나의 세포 레이어를 가지고 있으며,이 모든 세포가 유리 슬라이드에 동일한 평면에 평평하도록 따라서 중요하다. 세포는 endopolyploid하고 시각화하기 쉽습니다. 잘 해부하는 지방 바디 샘플은 정상적인 세포 접촉을 유지해야하고, 해부 표본 주변에 최소한의 지방 globules (그림 6I, J)가 있어야합니다.

2 주 : 말벌 달걀이 숙주 면역 시스템에 의해 영향을받지 남아있다면, 그들은 initiat합니다거의 즉시 전자 개발. 기생충 (호스트 유충에서)의 초기 발달 단계를 해부 hemocoel (그림 8)에서 쉽게 액세스할 수 있습니다. 기생충의 계란 또는 애벌레 역시 뚱뚱한 몸 또는 다른 장기에 충실하거나, 단순히 해부 동안 유리 슬라이드에 슬립.

4. 면역 조직 분석

1. PBS에 대비 4 % paraformaldehyde로 5~10분 동안 고정하기 전에 지방 바디 슬라이드 5-10 분 후 제거 1X PBS를위한 에어 건조 림프의 땀샘. 각 슬라이드 염색법에 대한 몇 가지 해부하는 림프의 땀샘을 가질 수 있습니다. 후속 단계 수제 humidified 챔버로 고정된 샘플 슬라이드를 이동합니다. 이 챔버는 빈 플라스틱 micropipette 팁 상자의 하단에 접힌 축축한 종이 수건 두 조각을 배치하여 준비가되어 있습니다. 샘플로 하나 이상의 슬라이드는 팁을 들고 사용 구분선 위에 둘 수 있습니다.
2. 따라서 면역 조직의 분석 표준 방법에 따라 수행되는생체내 세포 라벨링 및 간접 immunohistochemistry의 ⁴ 결합.

5. 대표 결과

1. 말벌 감염은 유료 경로 기자 Drosomycin-GFP (그림 6G, J)의 표현을 활성화한다. 본 실험에서 유전자 발현에 말벌 – 침입의 효과는 Drs업자 ¹² 연결된 GFP-리포터를 사용하여 생체내의 시각이다. 감염되지 않은 컨트롤 동물에서 GFP 발현이 발견되지 않습니다. GFP 신호를 명확 L.에 감염된 동물로부터 해부, 지방 신체의 세포의 세포질과 핵에서 발견 victoriae. 최상의 결과를, 말벌의 비율을 구하려면 : 호스트 1시 10분이어야합니다. 감염은 최소 2 시간 동안 지속한다. 우편 침입은 Drs-GFP 신호 intensifies 많은 지방이 신체 세포도 최대 72시간의 ^1,4로 GFP 양성입니다.
2. 말벌의 감염 리터에 lamellocytes의 분화를 유도ymph 글랜드 (그림 6D). Lamellocytes이 둘러싸고 (그림 6H) 말벌 개발을 차단합니다. 림프의 땀샘은 L. 후 앞쪽에 엽 (叶)에 유도된 세포 변화를 시각화하는 해부하고 victoriae 감염. 새로 차별 lamellocytes는 해부 엽 (叶)의 주변에 존재하는, lamellocytes는 결함이 향상제 (MSNF9-GFP)에 의해 구동되는 GFP의 transgene으로 표시됩니다. 모든 세포는 rhodamine-라벨 phalloidin을 사용 filamentous actin과 시각입니다. , 앞쪽에 엽 (叶)의 무결성이 정상적으로 (그림 6C) 지속 엽을 둘러싸는 지하 멤브레인 이러한 분비에 교란되는 것을 확인할는 (그림 6D) 지금 불연속이다. 동일한 해부에서 hemolymph의 lamellocytes도 (그림 6G) 얼룩의 시각이 될 수있다;있는 일부 기생충 개발 (그림 6H)를 차단하기 위해 형성된 캡슐 구조와 연결됩니다.
3. Spätzle 단백질은 애벌레 림프 글랜드 (7C 그림, D) 대부분의 세포에 표시됩니다. 해부하는 림프의 땀샘에서 Spz을 감지하기 위해서, 우리는 polyclonal 안티 Spz 항체 ⁴ 림프의 글랜드의 세포를 더럽히는 것을위한 표준 프로토콜을 따라갔다. 생체내에서 말벌 감염 후 림프 글랜드 세포의 Spz 수준 증가는 (패널 그림을 비교해보세요. 7C, 전자 7G와 나, 그리고 패널 7D, 7H와 F, J).
4. 호스트 애벌레와 pupae (그림 8).에서 말벌 개발의 초기과 늦은 단계 말벌의 발달 단계를 조사하기 위해 감염된 유충은 산란 후 여러 시간 지점에서 해부한다. 여기 Leptopilina SPP에서이 단계의 예제를 보여줍니다. 감염된 야생 유형에서 디 melanogaster은 호스팅합니다.

<bR />는 그림 1. 다른 말벌 종과 말벌 달걀 산란. 모든 이미지는 Leica의 stereomicroscope를 사용하여 획득했다. Trichopria drosophilae 암컷 말벌 디로 달걀을 oviposits 호스트 번데기. C Melanized 명소로 Trichopria drosophilae의 산란의 melanogaster 번데기. B 확대는 산란의 사이트에서 상처 치유를 나타냅니다. D 기사 boulardi 남성. 전자 G. xanthopoda 여성. F L. victoriae의 여성. G L. heterotoma 수컷 (왼쪽)과 여성.

그림 2. 파리 / 말벌 군비 경쟁을 보여주는 라이프 사이클. 2 결과 중 하나에서 산란 결과입니다. 숙주 면역 반응 하나 말벌의 개발 (왼쪽), 또는 말벌을 차단하는 데 성공하면 숙주의 면역 respo 무력화시킵니다nses 및 (오른쪽) 성공합니다. Melk 및 Govind 1999 년 ¹⁸ 수정됨.

그림 3. 이전 해부 관심 장기를 보여주는 셋째 instar의 애벌레. 모든 이미지는 Leica의 stereomicroscope를 사용하여 획득했다. GFP (녹색)와 Hml> GFP의 유충은 림프의 글랜드의 개별 세포의 형광 (화살표)가 림프 글랜드의 일반적인 위치를 나타냅니다 그대로 동​​물 인치 유충은 형광 및 명시야 광학과 몇 군데했습니다. 화살촉는 텍스트에서 설명한 림프의 글랜드 해부 프로토콜에 중요한 위치를 가리 키도록. 그대로 anim의 장기의 위치를 표시하기 위해 지방 본문에 GFP 발현과 B CG> GFP의 유충알. 화살촉는 텍스트에서 설명한 지방 신체 해부 프로토콜에 중요한 위치를 가리 키.

4 그림. 수신자 부담 전화 경로의 parasitoid 공격. 핵심 구성 요소에 대한 숙주 면역 반응의 Immuno-유전자 회로가 표시됩니다. Spätzle (Spz)은 프로 테아제 Spätzle 가공 효소, SPE에 의해 활성화됩니다. 활성 Spz은 수신자에 대한 리간드로서의 역할을합니다. 세포내 신호는 지느러미와 DIF NF-κB의 전사 요소의 활성화로 연결됩니다. 선인장은 통로의 IκB 방지제 역할을합니다. Drosomycin, 정식 유료 경로 대상 유전자의 활성화는 (그림을 참조하십시오. 6I, J) GFP 기자와 함께 유전자 변형 뜬 종자를 사용하여 모니터링할 수 있습니다.

그림 5. L.에 대응 캡슐 의 victoriae의 침입뱀의> GFP-DL Drosophila 호스트. 뱀의 유전자의 확장기는 혈액 세포 ¹³ 표시됩니다. 이 확장기는 transgene에 GFP-지느러미 융합 단백질의 표현을 운전하면 지느러미는 캡슐과 합산을 이루는 일부 plasmatocytes 및 lamellocytes에서 GFP의 녹색 형광을 통해 감지된다. 모든 이미지는 자이스 혈구 LSM 공촛점 현미경을 사용하여 획득했다. L.의 계란 패널 B에 나온 샘플의 계란 명시적 GFP-지느러미의 뒷부분 끝에 victoriae. BD의 Lamellocytes (흰색 화살표). CD를 높은 배율은 EH 샘플은 filamentous actin (F-actin, 빨강)을 시각화하는 rhodamine-라벨 phalloidin로 counterstained있다 와 Hoechst 33258와 L.의 DNA를 (파란색). E 캡슐화된 난자를 시각화하는 방법 L.의 victoriae. F Melanized 캡슐 victoriae. GH L. victoriae infection 혈액 세포 (plasmatocyte 및 lamellocyte) 집계를 유도합니다.

6 그림. 말벌 감염에 대한 면역 반응. 패널의 이미지는 A와 B는 자이스 혈구 Axio 범위를 사용하여 획득했다. CJ는 자이스 혈구 LSM 공촛점 현미경을 사용하여 얻은 있었다 패널의 이미지. 투명한 표피를 통해 melanized 캡슐 말벌 달걀 (화살촉)를 보여주는 호스트 유충 있습니다. Hoechst 33258 물들일 B 대표 셋째 instar 애벌레의 림프 글랜드 모든 돌출부와 interspersed pericardial 세포의 세포를 보여준다. 스케일 바는 100 μ를 나타냅니다. CJ는 모든 샘플 Hoechst 33258 (라벨 핵까지)와 rhodamine phalloidin (F-actin에 레이블을 위하여)로 counterstained되었다. CD 앞부분의 림프의 글랜드 엽 (叶) 컨트롤에서 (C) 및 기사 victoriae에 감염된 (D) MSNF9-GFP 동물. 라 특정 감염된 동물, MSNF 향상제 표현식에서,mellocytes ^14, 핵 GFP 기자와 함께 발견된다. 감염되지 않은 동물로부터 고립 전자 Plasmatocytes이 GFP를 표현하지 않습니다. 이 동물들은 거의 가지고있는 경우 lamellocytes. L.에서 약한 핵 GFP 발현과 F Plasmatocytes (GFP-음성, 짧은 화살표)와 새로 차별, 더 큰 lamellocytes (긴 화살표) L.의 hemocoel에서 victoriae에 감염된 MSNF9-GFP 유충. G 무료 및 집계 plasmatocytes 및 lamellocytes victoriae에 감염된 Drs-GFP의 유충. Drs-GFP 기자의 표현은 어떤 plasmatocytes (짧은 화살표)이 활성화 있지만 lamellocytes의 (긴 화살표) 이후의 감염. H는 캡슐과 L.에서 melanized 말벌의 유충되지 않습니다 MSNF9-GFP 호스트 유충을 boulardi – 감염. 수많은 MSNF9-GFP 양성 lamelloctyes은 말벌의 유충 (어두운 구조, 두꺼운 화살표)을 포위하고 강력한 핵 GFP 발현을 (긴 화살표) 나타냅니다. 이 팬엘 이전에 PLoS에 한 ¹⁵ 출판. IJ 지방의 신체 세포가 감염되지 않은 (I)와 L.에서 해부 victoriae에 감염된 (J) Drs-GFP의 유충. GFP는 핵 및 감염된 동물의 지방이 신체 세포의 세포질입니다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

그림 7. parasitoid 말벌 감염 후 Spätzle 표현. AJ 샘플은 DNA를 시각화하는 Hoechst 33258로 counterstained되었다. 모든 이미지는 자이스 혈구 LSM 공촛점 현미경을 사용하여 획득했다. 감염되지 않은 yw의 애벌레에서 해부하는 AF 앞쪽에 돌출부가 있습니다. 샘플은 일차 항체없이 간접 immunostaining 수 있도록 처리 (A와 B) 또는 안티 Spz 항체 (적색, C, D, E, F)로되었으며 (녹색 레이블 세포의 F-actin에 알렉사 밀가루 – phalloidin로 counterstained;G, H, I, J)와 알렉사 형석-phalloidin (녹색;. 감염된 yw의 애벌레와 스테인드 안티 Spz 항체와 (빨간색으로 해부하는 B, D, F) GJ 앞쪽에 엽 (叶). 패널 H, J) EF 높은 배율 각각 각각 C와 D, G와 H의 샘플. IJ 높은 배율에서 샘플. 패널 광고, G의 스케일 바, H는 50 μm의를 나타냅니다.

그림 8. L.의 애벌레와 pupal 단계 heterotoma와 L. 표시된대로 boulardi. 개별 단계는 애벌레 또는 pupal 플라이 호스트 포스트 침입으로부터 격리되었다. 모든 이미지는 자이스 혈구 Axio 범위를 사용하여 획득했다. 끝줄 AF L.가 heterotoma 단계, 1-6일 감염 후. 회 연속 AF Postembryonic L. boulardi 단계, 감염 후 4-12일.

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9 그림. 실험 프로토콜의 플로우 차트.

Discussion

Drosophila의 기생 말벌에 대한 관심은 전체 genomes를 해독하기위한 분자 기술은 효율적이고 비용 효과가로 서징있다. 그러나 그들의 매우 잘 공부 호스트에 상대적으로, 말벌 생물학의 많은 매혹적인 측면이 모호한 상태로 유지됩니다. 이러한 범위, 면역 억제, superparasitism, 그리고 행동을 호스팅과 관련된 문제가 포함됩니다. 이 프레 젠 테이션의 초점은 파리의 면역 조직에서 감염의 효과를 입증하는 것이었다. 여기를 시연 해부 기술은 RNA 레벨 (원위치 하이브리드화의 경우)이나 microarrays이나 PCR, 또는 단백질의 서양 분석을위한 핵산의 추출을위한 유전자 발현의 분석에 사용될 수 있습니다. 플라이 종자의 광대한 다양한 주식 센터와 면역 세포를 조작 및 레이블 개별 연구 실험실에서 사용할 수 있습니다. 플라이 종자의 선택은 실험적인 질문에 의해 결정됩니다. 이러한 해부 기술은 또한 면역의 분석에 사용될 수 있습니다다른 Drosophila 수종의 조직.

Materials

Yeast	Fisher Scientific	S80245-3	Active Dry
Fly Food	Home made	Corn meal, sugar	Standard
Honey	Dutch Gold	From the store	Clover
Vials	Fisher Scientific	AS514
Cotton plug/Foam stopper	Fisher Scientific	14-127-40A
Spatula	Fisher Scientific	21-401-15
Pyrex dissecting dish	Fisher Scientific	50-930-382	9-well
Microscope slides pre-cleaned	Fisher Scientific	7101	25.4 mm x 76.2 mm
Glass coverslips	Pearl	D12544	22 x 50
Glass coverslips	Pearl	G12544	22 x 60
Pasteur Pipette	J H Berge	71-5200-05
100 mm Tweezers	Sigma-Aldrich	T-4662	Style # 5
Wash Bottle	Fisher Scientific	03-409-22A	Fisherbrand
Kim Wipess	Fisher Scientific	34155	Kimberly Clark
Paper Towel	Fisher Scientific	Fisher X-101-C	1/8 x 13 1/8 in.
Leica stereomicroscope	Empire Imaging Systems, INC.	10446208	MZFLIII
Zeiss Stereomicroscope	Carl Zeiss, Inc.	000000-1006-126	"Stemi" 1000 or 2000-C
Light Source -LED Gooseneck illuminator	Fisher Scientific	12563501
Stage	Carl Zeiss, Inc.
Zeiss Laser 510 Scanning Confocal Microscope	Carl Zeiss, Inc.
Incubator	Thermo Fisher Scientific, Inc.	815
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Salt Solution 1X	Fisher Scientific	MT-21-030-CM Mediatech
Ethanol	Fisher Scientific	64-17-5	99.5 %
Formaldehyde (37% w/w)	Fisher Scientific	F79-1
H–chst 33258	Molecular Probes, Life Technologies	H-1398	0.2 μg/ml Excitation 352 nm; Emission 461 nm
Rhodamine phalloidin	Molecular Probes, Life Technologies	R415	200 units/ml (6.6 μM) Excitation 546 nm; Emission 565 nm
Alexa Fluor 488 phalloidin	Molecular Probes, Life Technologies	A22289	Excitation 495 nm; Emission 518 nm 300 units/ml
CO<sub>2</sub> tank	TW Smith
Anti-Spz antibody	Gift Dr. C. Hashimoto (Yale)
Secondary antibody TRITC-conjugated donkey anti-rabbit, concentration 1:50.	Jackson ImmunoResearch	711-165-152	Detected at Excitation 546 nm; Emission 565 nm
Antifade	MP Biomedicals	ICN10274790	0.08 mg of N-propyl gallate in 20 ml of 50% glycerol in 1X PBS
<strong>Wasp Strains</strong>			<strong>Fly Strains</strong>
<em>L. victoriae</em><sup>16</sup>			<em>y w</em>
<em>L. boulardi 17</em><sup>1</sup>			<em>UAS-GFP-Dorsal</em><sup>17</sup>
<em>L. heterotoma</em><sup>2</sup>			<em>SerpentHemoGal4</em><sup>13</sup>
<em>L. heterotoma 14</em><sup>1</sup>			<em>MSNF9-moCherry</em><sup>14</sup>
<em>Trichopria drosophilae </em>			<em>MSNF-GFP</em><sup>15</sup>
<em>G. xanthopoda</em><sup>18</sup>			<em>y w Serpent-Gal4 UAS GFP-Dorsal/Basc</em><sup>4</sup>
<em>y w ; Drosomycin-GFP/CyO y+</em><sup>12</sup>