Summary
نحن تصف استخدام perfluorodecalin كوسيط الارتشاحي المتزايدة. هذه هي طريقة بسيطة لتحسين عمق في التصوير
Abstract
ومن المعترف به على نطاق واسع لمشكلة الحصول على صور عالية الدقة في عمق العينات البيولوجية 1. في الهواء مملوءة الأنسجة مثل mesophyll الاسفنجية من أوراق النبات أو الرئتين الفقاريات المزيد من الصعوبات الناجمة عن التحولات المتعددة في معامل الانكسار بين المكونات الخلوية ، وبين الخلايا وأجوائها ، وبين الأنسجة البيولوجية وبقية النظام البصري. علاوة على ذلك ، عدم التطابق معامل الانكسار يؤدي إلى توهين من الإثارة وانبعاث fluorophore في إشارة المجهري مضان. نحن هنا وصف تطبيق المشبعة ، perfluorodecalin (PFD) ، كوسيط التصوير الارتشاحي مما يحسن الليزر بصريا المسح المجهري متحد البؤر (LSCM) على عمق التصوير عينة ، من دون اللجوء الى الزيادات الضارة في قوة الليزر ، والحد الأدنى من التأثير الفيزيولوجي 2. نحن تصف البروتوكول لاستخدام PFD مع Arabidopsis thaliana الأنسجة ورقة ، وهو مجمع بصريا نتيجة لهاهيكل (الشكل 1). PFD لديها عدد من السمات التي تجعلها مناسبة لهذا الاستخدام 3. معامل انكسار PFD (1.313) هو مقارنة مع تلك المياه (1.333) ، وأقرب إلى العصارة الخلوية (حوالي 1.4) من الهواء (1،000). بالإضافة إلى ذلك ، PFD في متناول الجميع ، غير الفلورسنت وغير سامة. التوتر السطحي انخفاض PFD (19 سم dynes -1) هو أقل من المياه (72 سم dynes -1) ، وأيضا أقل من الحد (25 -- 30 سم داين -1) لاختراق فوهي 4 ، مما يسمح لها الفيضانات وأجوائها mesophyll إسفنجي دون تطبيق فراغ يمكن أن تكون مدمرة أو السطحي. أخيرا والأهم من ذلك PFD لديه قدرة كبيرة على تذويب CO 2 و O 2 ، والذي يسمح بالإبقاء تبادل الغاز في الأنسجة غمرت المياه ، مما يقلل من تأثير على العينة الفسيولوجية. وقد استخدمت هذه الخصائص في مختلف التطبيقات التي تشمل التنفس السائل جزئية وinfla الرئة5،6 نشوئها ، والجراحة 7 ، 8 الدم الاصطناعي ، الأوكسجين في نمو وسائل الاعلام 9 ، ودراسات لتكوين بلورات الجليد في النباتات 10. حاليا ، فمن الشائع أن يشن في الماء أو الأنسجة العازلة للتصوير المائي مبائر حية. نحن نعتبر أن استخدام PFD كوسيلة متزايدة يمثل تحسنا في الممارسة الحالية وتسمح للتحضير عينات بسيطة من العيش ورقة كاملة للتصوير.
Protocol
بروتوكول الواردة أدناه توضح طريقة بسيطة لاستخدام PFD كوسيط الارتشاحي المتصاعدة في أوراق thaliana Arabidopsis ، لكننا نتوقع أن تكون قد استخدمت هذا الأسلوب في مجموعة متنوعة من التطبيقات حيث هو المطلوب التصوير الجوي الغنية الأنسجة.
1. عينات نبات المتصاعد في PFD
- إعداد شريحة المجهر مع طوقا من الغاز نفاذية polydimethylsiloxane (PDMS ، كارولينا مراقبة جل). PDMS هو بوليمر اللزجة ويمكن مصبوب لتوفير غرفة مصممة خصيصا لمتطلبات التجريبية.
- PFD تتوازن مع الهواء. ويمكن تحقيق هذا عن طريق محتدما مع الهواء أو عن طريق هز وحدة تخزين صغيرة من PFD في زجاجة مليئة بالهواء.
- PFD صب في طبق بيتري المفتوحة وتعويم الشتلة كليا أو رفعه على أوراق PFD لمدة 5 دقائق. يجب أن تصبح الأنسجة شفافة ، تشبه أنسجة المزجج (الشكل 2 (أ)). قد يبدو أكثر قتامة أو أوراق أخف من ذي قبل التعرض لPFD ، depenقرع على استخدام ظروف الإضاءة وعمر الأنسجة.
- تملأ الغرفة PDMS مع الهواء ومعايرتها PFD نقل بعناية عينات الأنسجة من الحضانة طبق بتري إلى غرفة PDMS. ختم الشريحة مع ساترة والصورة وفقا لمتطلبات التجريبية.
- ملاحظة : PFD ينفذ بشكل جيد أيضا في غرفة مفتوحة بنيت على ساترة أو في غرفة نضح ومتوافق مع الشحوم السيليكون. PFD غير متوافق مع مكونات تفلون كما يذوب فيها.
2. ممثل النتائج :
التفتيش المجهري لعينات أوراق PFD - المحتضنة يظهر أن غمرت المياه معظم أجوائها. الشكل 2 (ب) يبين أجوائها غمرت مع وقف التنفيذ في المؤتلف GFP PFD. فمن الواضح أن غمرت المياه على ورقة مع PFD الحضانة ، ولكن من حين لآخر جيوب الهواء قد تبقى. مياه الفيضان لا ورقة في ظل هذه الظروف. LSCM عينات المحتضنة والتي شنت في الأشعة تحت الحمراء ، يظهر الماء أو PFD PFD أن يعطي ميزة على الماء والهواء في عمق التصوير المحتملة (الشكل 3). المثال الوارد في الشكل 3 يبين الهواء والماء وشنت PFD Arabidopsis يترك التعبير عن فينوس المترجمة cytosolically ، وهو البديل من YFP ال 11 التي يتم التعبير constitutively تحت المروج 35S. يمكننا أن نرى تقريبي 2 أضعاف زيادة في عمق التصوير عند مقارنة PFD والمياه. وتجدر الإشارة إلى أنه ، مع ذلك ، أن تحسين دقة المشاهدة عند استخدام PFD يختلف مع الفتحة العددية للعدسة ، ونوع من النسيج المستخدمة. لقد شهدنا تدفق حشوية والجذرية استطالة الشعر في PFD الشتلات المعالجة ، كل الإرشادية من النباتات الصحية. بالإضافة أظهرنا (2) أن FV / FM ، وهو مقياس لأداء التمثيل الضوئي للنباتات لا يزال في حدود 12 تحمله خلال فترات زمنية المستخدمة في التصوير.
3394fig1.jpg "/>
الشكل 1. أوراق النبات التعقيد والآثار البصرية
Diagrammatical التمثيل تبين الخصائص التشريحية للألف أوراق thaliana فيما يتعلق البصرية انشاء. المختصرات المستخدمة هي الكائنات. = الهدف العدسة ، IMM. = السائل الغمر ، COV. = ساترة ، MNT. = mountant ، قطع. = بشرة ، الإعلانية. الجيش الشعبي. = متجه نحو المحور البشرة ، ش. = المسام فوهي ، س. = mesophyll الاسفنجية ، كما = الفضاء الجوي ، PAL. = الحسيكة mesophyll ، VB = حزمة الأوعية الدموية ، والإعلان. الجيش الشعبي. = متجه نحو المحور البشرة. يشار إلى جدران الخلايا بواسطة خطوط سوداء.
الشكل 2. PFD تخترق بسهولة يترك Arabidopsis
(أ) أوراق المحتضنة في الهواء أو الماء أو PFD لمدة 5 دقائق والمصورة باستخدام كاميرا رقمية لايكا DCF3000FX مع المجهر MZ16F ايكا (لايكا مايكروسيستمز (المملكة المتحدة) المحدودة ، وميلتون كينز ، المملكة المتحدة). وقد طبع الشعار على الفيلم إن الرب خلات ومضيئة جيئة وذهابامتر تحت الضوء مع مربع. كان زمن التعرض 89 مللي ، وجمعت كل الصور ومعالجتها بشكل مماثل. أشرطة النطاق تمثل 2 ملم.
(ب) تحمل PFD المنقى المؤتلف البروتين الفلوري الأخضر (GFP) يحد أجوائها في الجسم الحي. GFP خضراء اللون كاذبة ، ويستخدم لإظهار الحمراء لصناعة السيارات في مضان الكلوروفيل الذي يفصل الخلايا mesophyll. (الشكل 2 (ب) مستنسخة بإذن والتفاصيل التقنية الكاملة المتاحة في ليتل وآخرون 2010 2). أشرطة النطاق تمثل 25 م
الشكل 3. PFD يحسن التصوير مبائر في الأوراق
التقط الصور يترك LSCM تظهر المترجمة cytoplasmically فينوس مضان (الأخضر) ، وتألق ذاتي الكلوروفيل (الحمراء) في thaliana ألف سليمة في الهواء أو الماء أو PFD. وكان طول الموجة 514 نانومتر ، والإثارة وسجلت الانبعاثات مضان في 518 نانومتر 604 نانومتر لفينوس وعلى 657 نانومتر679 نانومتر لالبلاستيدات الخضراء. كل لوحة هو مقطع واحد متحد البؤر مأخوذة من Z - 11 كومة من الصور مبائر المكتسبة في فترات 5 ميكرون. تم استخراج هذه من كومة - Z كامل من 59 صور حصلت على 1 ميكرومتر فترات ، والتي تم استخدامها لإنتاج الأفلام التكميلية. وترد قياسات العمق النسبي لسطح البشرة. وتظهر الصور التمثيلية ، والتي تم تجهيزها بشكل مماثل. تفاصيل التجريبية مثل إعدادات المجهر مماثلة لتلك الموجودة في ليتل وآخرون ، 2010 2. Scalebars تمثل نحو 20 ميكرومتر.
Discussion
هذا هو أسلوب بسيط وسهل الاستخدام لتحسين الفحص المجهري للهواء أو معقدة مليئة بصريا الأنسجة. لقد أظهرنا أن لديه بعض مزايا تقنية قوية ، ونحن نأمل أن يتم استخدامها لتوضيح المسائل المتعلقة البيولوجية في الهواء الغنية الأنسجة. على سبيل المثال فإنه سيكون خيارا طبيعيا للدراسات من مهاجمة مسببات الأمراض النباتية في mesophyll أو في الرئتين. ونحن أيضا على بينة من القيود المفروضة على هذه التقنية. نحن نعمل على تحسين مطابقة معامل الانكسار ، مع استخدام وسائل أخرى للالمجهري ، وتجديد المشبعة mountant خلال التجارب الزمني الطويل. ونحن ندرك أيضا ، على الرغم من أن واحدة من المزايا الرئيسية لبالفلور ، ويجري وهي خاملة بيولوجيا والجانب الثاني. بالفلور لا تذوب بسهولة الجزيئات البيولوجية مما يعني أيضا أنه لا يمكن استخدامها بسهولة لتوفير مركبات ذات الأهمية مثل الهرمونات ، والمخدرات ، والجزيئات الصغيرة الأخرى أو الأيونات.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر البروفيسور نيكولاس سميرنوف من جامعة اكستر لنصيحته ، وجامعة اكستر مرفق Bioimaging. وقدم التمويل من جانب المملكة المتحدة الحيوية والعلوم الحيوية مجلس البحوث (منحة مرجع BB/E002682/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
| Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |
References
- Inoue, S. Foundations of Confocal Scanned Imaging in Light Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd. Pawley, J. P. , Springer Science & Business Media, LLC. New York. 1-16 (2006).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C. S. mirnoff, N,, Love, J. Perfluorodecalin substantially improves confocal depth resolution in air-filled tissues. New. Phytologist. 186, 1018-1025 (2010).
- Sargent, J. W., Seffl, R. J.
- Schönherr, J., Bukovac, M. J.
- Davies, M. W.
- Shaffer, T. H., Wolfson, M. R., Greenspan, J. S., Hoffman, R. E., Davis, S. L., Clark, L. C. Liquid ventilation in premature lambs: uptake, biodistribution and elimination of perfluorodecalin liquid. Reprod. Fertil. Dev. 8, 409-416 (1996).
- Crafoord, S., Larsson, J., Hansson, L. J., Carlsson, J. O., Stenkula, S. The use of perfluorocarbon liquids in vitreoretinal surgery. Acta. Ophthalmol. Scand. 73, 442-445 (1995).
- Lowe, K. C. Engineering blood: synthetic substitutes from fluorinated compounds. Tissue Eng. 9, 389-399 (2003).
- Wardrop, J., Edwards, C. M., Lowe, K. C., Davey, M. R., Power, J. B. Cellular responses of plant protoplasts to culture with oxygenated perfluorocarbon. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 501-505 (1997).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of fluorocarbons to study freezing in plant tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annu. Rev. Plant. Biol. 59, 89-113 (2008).
