방법 논문

전파와 녹색 형광 단백질을 표현 Maedi - visna 바이러스의 감염성 분자 클론을 검출

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DOI:

10.3791/3483

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2011년 10월 9일

 , 
1Institute for Experimental Pathology, University of Iceland

이 논문에서

요약

우리는 GFP를 표현하고 완전히 전염성이있다 maedi - visna 바이러스의 분자 클론을 설명합니다. 이 바이러스의 복제는 형광 현미경과 유동세포계측법를 사용하여 검색하실 수 있습니다.

초록

Maedi - visna 바이러스 (MVV) 천천히 진보 간질성 폐렴 및 뇌염 1 원인, 양 lentivirus입니다. 생체내의 MVV의 주요 대상 세포는 단핵구 혈통의 2로 간주됩니다. MVV의 일부 변종 그러나 3,4, 다른 세포 유형에 복제할 수 있습니다. 녹색 형광 단백질은 살아있는 세포에 lentiviruses 공부를 위해 일반적으로 사용되는 마커입니다. 우리는 MVV의 dUTPase에 대한 유전자에 egfp 유전자를 삽입했습니다. dUTPase 유전자는 잘 양과 염소의 대부분 lentivirus의 변종에 보존하고 CAEV 5 복제에 중요하다고 표시되었습니다. 그러나, dUTPase는 체외에서 생체내 6 모두 본 연구에 사용된 MVV의 분자 클론의 복제 소모품으로 표시되었습니다. MVV 복제는 엄격히 양이나 염소 원산지 세포에 국한됩니다. 우리는 transfection 및 바이러스 7 전파에 대한 양의 맥락막 얼기 (SCP 세포)에서 기본 세포 라인을 사용합니다. 형광 MVV 완전히 전염성이며 EGFP 표현은 적어도 6 구절 8 이상의 안정이다. TCID 50 EGFP 측정 사이 좋은 상관 관계가있다. 이 바이러스는 따라서 세포 tropism와 체외에서 생체내 8 pathogenicity 연구에 감염된 세포의 신속한 검출에 유용합니다.

프로토콜

1. Transfection

분자 복제는 각각 12킬로바이트 및 4.5 킬로바이트 두 plasmids, p8XSp5 - egfp과 p67r에 포함되어 있습니다. 9,10

  1. 두 plasmids, 즉 p8XSp5 - egfp의 4.4 μg과 transfection 전에 XbaI과 ligate과 p67r의 1.6 μg의 몰 수량 잘라.
  2. 내고 들어, 16 ° C 하룻밤에 50 μl 반응과 부화에 ligase 1 와이즈 단위를 사용합니다.
  3. 결합이 완료되면 ° C ligase의 불활 성화 15 분 65 내고 믹스를 품어. 이 단계는 생략할 수 있습니다.
  4. 이틀 전 transfection, 종자 10 6 SCP의 T25 조직 문화 플라스크에 세포, 그리고 confluency 90 % monolayer에 항생제없이 5 ML DMEM + 10% 양고기 혈청과 2mM의 글루타민에서 이틀 동안 세포를 성장. 세포 이틀 후 confluency 90 %에 도달하지 않은 경우 세포가 하나의 추가 일 성장을 둡니다.

참고 : 양고기 혈청이 태아 소 혈청 (FBS)으로 대체하실 수 있습니다. MVV의 일부 변종은 FBS에 의해 저해되기 때문에 우리는 정기적으로, 양고기 혈청을 사용하여,이 MVV 변형은 그러나, FBS에 의해 저해하지 않습니다.

  1. 세포 transfection에 대한 준비가되면, 항생제없이 1 %의 혈청 (양 혈청 또는 FBS)과 DMEM에 매체를 변경합니다.
    우리는 transfection에 대한 Lipofectamin 2000 (Invitrogen)을 사용합니다.
  2. 500μl Opti - 가상 매체에서 DNA를 희석.
  3. 500μl Opti - 가상 매체에 20μl Lipofectamin 2000을 희석하고 5 분 실온 (RT)에 둡니다.
  4. 5 분 부화 후 희석 Lipofectamine 2000 (총 부피 = 1000 μl)로 희석 DNA를 결합. 부드럽게 믹스와 RT에서 20-30 분 알을 품다.
  5. SCP 세포와 미디어 (5 ML)이있는 T25 술병에 transfection 믹스 (1 ML)를 추가합니다. 부드럽게 락을로 섞는다.
  6. 37 품어 ° C와 5% CO 밤새 2 (18-24 H).
  7. 1 %의 묘약, 2mM 글루타민, 100IU 페니실린과 스트렙토 마이신과 100IU DMEM 중간 다음날을 변경합니다.
  8. 거꾸로 형광 현미경으로 SCP 세포에서 GFP의 생산을 모니터링합니다. 15 % - 낮은 transfection 효율은 보통 5이 기본 세포와 기대하실 수 있습니다.
  9. 37 더 품어 ° C, 5 %는 술병에있는 바이러스의 확산 있도록 몇 일 동안 CO 2. 그것은 일반적으로 전체 감염 7~14일 소요됩니다.
  10. Eppendorf 튜브에 뜨는를 aliquoting하여 바이러스를 수확. 세포 파편을 제거하는 5 분 3,000 RPM에서 microfuge에 스핀. 새로운 튜브에 바이러스를 포함하고있는 뜨는을 전송합니다. -80에서 보관 ° C.

2. 바이러스의 적정

  1. 10% 혈청, 2mM 글루타민, 100IU/ml 페니실린과 스트렙토 마이신의 100IU/ml, 당 우물에 96 잘 판과 보충 100 μl DMEM 매체의 씨앗 3x10 4 SCP 세포를. 37 품어 ° C 5 % CO 2.
  2. 세포 다음날 합류하는 경우, 1 % 혈청, 2mM 글루타민, 100IU/ml 페니실린과 스트렙토 마이신 100IU/ml의 각 물론 100 μl와 DMEM에 매체를 변경합니다.
  3. 다음과 같은 방법으로 바이러스를 희석 :
    1. 2mM 글루타민, 100IU/ml 페니실린과 96 잘 원형 바닥이나 V - 하단 플레이트 4 X 10 우물에 잘 따라 100IU/ml 스트렙토 마이신, 1 %의 혈청 180 μl DMEM을 추가합니다.
    2. 사통으로 작성된 열배 시리얼 dilutions 들어, 샘플이 완전히 혼합되는 것을 보장하기 위해 아래 판의 첫 ​​번째 열에 4wells 각 바이러스의 20 μl를 추가하고, 4 채널 피펫을 사용하여 최대 피펫합니다. 피펫 팁을 변경하고 다음 네 우물 등 20 μl를 전송. 부정적인 제어를위한 바이러스 않고 마지막 우물을 둡니다.
  4. SCP 세포와 매체 바이러스 dilutions 100 μl를 추가합니다.
  5. 37 ° C와 5% CO 2를 품어. 두 주 동안 GFP 형광 및 cytopathic 효과를 관찰.
    Cytopathic 효과 multinuclear 나타나는 세포 및 세포 죽음으로 끝나는, 둥글게 뻗어 프로세스 정상 세포보다 투명되고 세포로 이루어져 있습니다.
  6. 리드 Muench 방법 11을 사용하여 바이러스 titer (TCID50)를 계산합니다.

3. 감염된 세포의 FACS 분석

참고 : 바이러스의 복제의 신속한 모니터링, 감염된 세포 유동세포계측법 검사를하실 수 있습니다.

  1. 감염된 세포를 (CA 10 5) Trypsinize, 500μl의 PBS PBS와 resuspend와 1X 씻는다.
  2. 30 분 RT에서 품어 500 μl 4 % paraformaldehyde 용액 (2 % 최종 농도)를 추가합니다.
  3. 5 분 3,000 RPM에서 microfuge의 펠릿 세포.
  4. PBS 2x5 분들과 씻고 FACScan 분석기에서 분석합니다. 10000 이벤트를 계산합니다.

4. 대표 결과 :

10 7 TCID 50 / ML -이 바이러스는 전염성이 완전히 10 6 titer로 복제되어야합니다. 감염된 세포는 형광되며 det 수 있습니다유동세포계측법 및 형광 현미경에 의해 ected. 일반적으로, GFP는 유동세포계측법 (그림 1)를 사용하여 감염된 세포 배양에서 세포의 60 % 이상에서 발견하실 수 있습니다. 마찬가지로, 형광 현미경에 의해 시각 때, 세포의 대부분은 (그림 2A와 B) 형광 있습니다.

그림 1
그림 1. 감염 7 일 후 KV1772 - egfp 바이러스에 감염된 세포의 SCP FACScan 분석.

그림 2
배양 7 일 (A) 이후 KV1772 - egfp에 감염 SCP 전지의 그림 2. 위상 콘트라스트 현미경. 같은 세포는 형광 현미경 (B)에 의해 시각.

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토론

여기서 제시 MVV의 분자 클론을 표현 GFP는 호스트 세포의 상호 작용과 체외 및 생체내 두 MVV의 pathogenicity을 분석하는 데 유용합니다. 복제 7~14일 후 얻은 바이러스는 의심할 여지없이 반전 transcriptase의 부정확으로 인해 일부 변이를 인수했다. 그러나, 단일 사이클 벡터로 복제의 사용에 제한이 있습니다. 하나는 복제의 사용이 양 염소 원산지 세포로 제한되어 있기 때문입니다. 우리의 구조를 사용하여 이러한 세포의 transfection 효율은 5~15%이며, pEGFP - N3 벡터를 사용하여 transfection 효율은 293 - T 세포를 사용하여 90 % 이상에 비해 15~20%입니다. 293 - T 세포는 MVV 벡터에 대한 포장 세포로 테스트하지만, 결과 바이러스 입자는 양 세포와 정체 불명의 제한 요인으로 인해 아마도 293 - T 세포 모두 12 비 전염성이 입증되었습니다. 전염성 클론은 다른 단점이다이 plasmids에 포함되어 있습니다. 이것은 전체 길이 복...

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공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

이 작품은 아이슬란드어 연구 기금과 연구 기금 아이슬란드 대학에 의해 투자되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호
DMEM Gibco 10938025
Opti - 가상 Gibco 51985018
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019

참고문헌

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