고체 Nanopores와 모니터링 단백질 흡착

요약

무기 표면에 단백질이 아닌 구체적인 흡착을 모니터링하는 고체 nanopores를 사용하는 방법을 설명합니다. 방법은 실시간과 단일 분자 수준에서 탐색할 수 흡착 수있게 저항 펄스의 원칙을 사용합니다. 하나의 단백질 흡착 과정 멀리 평형에서이기 때문에, 우리는 양적 단백질 흡착의 상수 명백한 처음 주문 반응 속도의 결정뿐만 아니라 및 Langmuir 흡착 상수 사용, 합성 nanopores의 병렬 배열의 고용을 제안합니다.

초록

고체 nanopores은 지역 구조와 유연성 핵산 ^1-6, 단백질 ⁷ 전개, 그리고 다른 리간드 ⁸ 바인딩 선호도를 조사하는 단일 분자 수준에서 측정을 수행하는 데 사용되었습니다. ^9-12 저항 펄스 기술로 이러한 nanopores을 결합함으로써, 그러한 측정은 다양한 조건 하에서와 라벨 ^3에 대한 필요없이 할 수 있습니다. 저항 펄스 기술에서는 이온 소금 솔루션은 nanopore의 양쪽에 도입입니다. 따라서, 이온은 지속적으로 현재의 결과, 적용 transmembrane 잠재력에 의해 챔버의 한쪽에서 다른 구동됩니다. nanopore에 analyte의 파티션은 단일 분자 정보를 추출하는 분석할 수이 현재에 잘 정의된 편향을 발생합니다. 이 기법을 사용하여 nanopore 벽에 단일 단백질의 흡착은 다양한 범위의 아래에 모니터할 수 있습니다조건 ^13. microfluidic 장치의 크기 축소로, 하나의 단백질과 함께 이러한 시스템의 상호 작용이 우려되고 있기 때문에 단백질 흡착은 중요성이 높아지고있다. 이 프로토콜은 쉽게 nanopore 드릴링 의무가 다른 박막, 또는 작용 질화 표면에 확장될 수 있습니다 질화물 필름에 바인딩 단백질에 대한 신속한 분석을 설명합니다. 단백질의 다양한 솔루션 및 denaturing 조건 하에서 광범위한 탐험 수 있습니다. 또한이 프로토콜은 nanopore 분광법을 사용하여보다 기본적인 문제를 탐구하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 실리콘 질화물 점막에서 고체 nanopores의 제조

1. 200 kV의 가속 전압에 황비홍 Tecnai F20 S / TEM을 가져와. 다른 S / TEM을 사용하는 경우, 가속 전압보다 크거나 200 kV ^{9이어야합니다}
2. TEM 샘플 홀더에 20 nm의 두꺼운 SPI 실리콘 질화물 창 그리드를로드하고 소유자로부터 오염 물질을 제거하는 30 초 동안 산소 플라즈마로 닦아주십시오.
3. S / TEM에 샘플을로드하고 아래 펌프로 진공을위한 수 있습니다. S / TEM 진공로 펌핑되면 Ronchigram에서 밝은 사각형를 찾아 밝은 필드 TEM 모드에서 질화 윈도우를 찾으십시오. TEM이 제대로 정렬되어 있는지 확인 후, 정렬 및 샘플을 중점을두고 있습니다.
4. 줄기 모드로 S / TEM을 전환합니다. 이미지 샘플를 HAADF (또는 이에 상응하는 금액) 검출기를 사용하여 제대로 정렬되어 있는지 확인하십시오.
5. 낮은 값을 단색을 설정합니다. 단색의 낮은 가치 높은 curren를 허용시추에 사용할 전자 t. S / TEM은 단색이없는 경우이 단계를 무시합니다.
6. nanopore를 시추에 적합한 장소 크기를 선택합니다. 이것은 전자 프로브의 직경에 해당합니다. 3 NM 프로브는 5 ....

토론

고체 표면에 ^27-29로 단백질의 자연 흡착는 biochip 응용 프로그램 및 기능 하이브리드의 biomaterials의 새로운 클래스의 디자인 분야의 숫자에 근본적으로 중요합니다. 이전 연구는 고체 표면에 adsorbed 단백질이 측면이나 이동성을 크게 탈착 속도를 표시하지 않는 것으로 나타났습니다, 따라서 단백질 흡착은 일반적으로 돌이킬 수와 특이 현상이 ^{프로세스를 30-32로} 간주됩니다. 고체 표면에 단백질 흡착은 고체 - 액체 인터페이스 ¹³ 단백질과 반응 그룹의 사이드 체인 간의 정전 기적 ​​및 소수성 세력 등 여러 가지 요인에 의한 것으로 생각됩니다.

단백질 흡착 과정은 이러한 석영 크리스탈 microbalance ^28,29, 전자 현미경, ^33,34 타원 편광 반사 측정법 ³⁵ 형광 라벨링, ³⁶ plana로 접근의 숫자에 의.......

재료

시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Tecnai F20 S / TEM	페이		S / TEM은 가속 전압 ≥ 200kV 및 현장 방출 소스를 필요로합니다.
TEM 20 NM 두꺼운 실리콘 질화 막 창	SPI	4163SN - BA
축삭 Axopatch 200B 패치 - 클램프 증폭기	분자 장치
축삭 Digidata 1440A	분자 장치
10 소프트웨어를 pCLAMP	분자 장치		전기 생리학 데이터 수집 및 분석 소프트웨어
황산	Fisher 과학	A300
과산화수소	피셔 과학	H325
실리콘 O - 링	McMaster - 카	003 S70	또한 PDMS를 사용하여
실버 와이어	시그마 - 올드 리치	348,759	전극에 대한
SPC 기술, D 하위 연락처, 핀	뉴어크	9K4978	전극에 대한
염화칼륨	시그마	P9541
인산 칼륨 이염	시그마	P2222
인산 칼륨 일염기의	시그마	P5379
PDMS	다우 코닝		Sylgar 184 Elastomer가 설정할 수 있습니다. 챔버를 만들기위한.
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