우리는 병아리 E4 statoacoustic 신경절 및 E6 척수의 explants을 해부하다 문화하는 방법을 보여줍니다. Explants는 24 시간 동안 3D 콜라겐 젤의 혈청 무료 조건에서 양식입니다. Neurite 대응은 성장 인자 - 보충 매체와 단백질 코팅 비즈와 함께 테스트됩니다.
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방법 논문
Neurite 가지의 Assays에 대한 해부와 칙 Statoacoustic 신경절과 콜라겐 젤에서 척수의 Explants의 문화
이 논문에서
요약
초록
닭 내이 (内耳)의 감각 기관은 statoacoustic 신경절 (SAG) 뉴런의 주변 장치 프로세스에 의해 innervated 있습니다. 감각 기관의 innervation이 성장 axons 및 / 궤도를 따라 그들의 감각 기관 목표 내에 축삭 안내 단서 1과 생존 요인 2 조합에 따라 달라집니다. 예를 들어, 전형적인 축삭지도 신호 경로, semaphorin - neuropilin와 기능 간섭은 귀의 axons 3 misrouting 생성. 또한, 여러 가지 성장 요인 Neurotrophin - 3 (NT - 3) 및 뇌 유래 Neurotrophic 팩터 (BDNF)를 포함 내이의 감각 대상, 표현하는 것은 다시 SAG의 axons 4 misrouting로 이어지는, 유전자 변형 동물에 조작되었습니다. 이 같은 분자 체외 5,6의 생존과 여자는 SAG의 뉴런의 neurite의 파생물을 모두 추진하고 있습니다.
여기서는 설명하고 체외 방법에서 현재 U있는 입증알려진 같은 Wnts 같은 morphogens뿐만 아니라, SAG의 neurite의 파생물 및 신경 세포 생존을 촉진에 중요한 성장 요인을 포함하여 가용성 단백질에 여자는 SAG의 neurites의 반응을 테스트하는 노래. 이 모델 시스템을 사용하여, 우리는 분비 리간드는 SAG의 신경 세포의 생존과 neurite의 파생물에 견딜수 수있는 효과에 대한 결론을 그릴 수 있도록 최선을 다하겠습니다.
SAG의 explants은 배아 일 4 (E4)에 해부 및 24 시간 동안 혈청이없는 조건 입체 콜라겐 젤의 양식입니다. 첫째, neurite 응답은 단백질 보충 매체 culturing의 explants에 의해 테스트됩니다. 그런 다음 분비 리간드의 포인트 소스 neurite 가지에 대한 방향성 영향을 미칠 수 있는지 여부를 물어, explants는 단백질 코팅 비즈와 공동 교양 및 지역 홍보 또는 파생물을 억제하기 위해 비드의 능력에 대한 assayed 있습니다. 우리는 또한 해부의 실연 (7 번 프로토콜 수정) 및 E6 척수의 explants 문화를 포함합니다. 우리정기적으로 단백질과 단백질 절어 구슬의 bioactivity을 확인하기 척수의 explants를 사용하고 SAG의 explants 같은 문화 조건에서, 병아리, 조직과 종에게 교차 반응을 확인할 수 있습니다. 시험 관내 assays에서 이들은 신속 특히 생체내에서 연구를 수행하기 전에, 영양 (생존) 또는 SAG의 뉴런에서 열대 (방향) 효과를 발휘 분자에 대한 심사를위한 편리합니다. 또한,이 방법은 높은 신경 세포의 생존 8, 혈청이없는 조건에서 각각의 분자의 테스트를 수 있습니다.
프로토콜
요리법
칙 Ringers
| 7.2 g | NaCl |
| 0.23 g | CaCl 2 + 2 시간 2 O |
| 0.37 g | KCl |
| 0.115 g | 나이 HPO 4 |
| 900 ML | 물 (조직 문화 학년) |
참고 : 7.4로 산도를 조정합니다. 물로 1,000 ML에 최종 볼륨을 가져와.
10X PBS
| 40g | NaCl |
| 1g | KCl |
| 7g | 나이 HPO 4 |
| 1.2 g | KH 2 PO 4 |
| 450 ML | DEPC 물 |
참고 : 7.4로 산도를 조정합니다. 최종 가져와물 500 ML에 볼륨. 작업 농도 (1X)는 같은 18 MΩ - cm의 전도성과 물을 생성하는 Millipore 자외선 조사 시스템 얻은로 조직 문화 등급 물 9 부분 1 부분 10X 주식을 diluting에 의해 이루어집니다.
explant 개최 매체 SAG
- L - 글루타민과 함께 DMEM/F12, 10 MM Hepes
- 10 % 인슐린, 전송, 셀레늄 (ITS +1)
- 1퍼센트 펜 - strep
Explant 문화 매체
- explant 개최 매체 SAG
- 10 NG / ML Neurotrophin - 3 (NT - 3)
- 10 NG / ML ciliary neurotrophic 인자 (CNTF)
척수의 해부 및 유지 매체
- L - 15
- 10% 소태아 혈청
- 1퍼센트 펜 - strep
37-38에서 부화 계란 ° C. 70 % 에탄올에 도구와 Sylgard 해부 접시를 해부 소독. 요리 도구를 해부하면 UV가 밤새 소독 수 있습니다.
1. 비드 준비
- 한 ML 무균 PBS, 믹스, 그리고 튜브의 바닥에 정착하는 비즈 기다리는와 microtube에 넣어 비즈.
- 비즈가 정착하고 PBS에 resuspend 후에 뜨는을 제거하여 비즈를 여러 번 씻으십시오.
- 상온에서 1 시간 동안 단백질 (PBS에 희석) 또는 PBS 혼자 (컨트롤)을 정화의 구슬을 품어.
- 콜라겐에 배치까지 1ml PBS로 24 잘 플레이트에서 PBS와 저장소의 구슬을 씻어.
2. Statoacoustic 신경절의 해부
- E4에서 난자에서 배아를 제거하고 배아 세포막을 제거하는 여자 울리는의 솔루션과 함께 접시에 넣습니다.
- 차가운 HBSS 최대 직면하고있는 귀의 소포와의 측면에 위치 배아를 가득 Sylgard © 늘어선 페트리 접시에서 배아를 놓습니다. 해부 핀을 사용하여 요리에 배아를 핀.
- 두 해부 핀을 사용하여 피부를 통해 수평 절단을 즉시 복부운하 파우치는 약 그것은 달팽이 덕트가 만나는 곳이. 수직 절단이 앞쪽에 있고 SAG에 후부합니다. 세 인하 마주하고 피부를 리프트하고 제거하는 포셉 또는 해부 핀을 사용합니다.
참고 : SAG는 brightfield 기본 조명과 함께 쉽게 볼 수있는 지느러미 파우치, 그리고 ventromedially 프로젝트와 pharyngeal 아치에 의해 왜곡시킨다 복부 달팽이 덕트 사이의 중간 정도 otocyst의 anteroventral 가장자리에 위치하고 있습니다. 달팽이 덕트 elongates는 dorsoventral 차원 있도록 점진적으로 햄버거 - 해밀턴 단계 9월 23일에서 25일까지 사이 E4에서 증가합니다.
- SAG에서 분리 사후 방향으로 otocyst를 당겨. 해부 핀과 SAG를 둘러싼 조직을 치환 조심스럽게 # 55 포셉를 사용하여 배아에서 SAG를 제거합니다. mesenchymal 조직 및 SAG에서 튀어나온 신경 번들의 큰 덩어리를 제거합니다.
- 넓은 입을 pipet 팁 사용으로 explant를 전송미디어를 들고 0.5 ML의 SAG의 explant 24 - 우물 판. 최대 4 시간 동안 얼음이나 실온에서 explants 보관하십시오.
3. 척수의 해부
- 난자에서 E6 배아를 제거하고 여자 울리는의 솔루션을 포함 접시에 넣습니다. 머리와 배아 세포막을 제거합니다.
- Sylgard에 몸을 © 차가운 척수의 해부 매체를 포함하는 해부 접시를 놓습니다. 위치와 실험자 직면하고있는 배아 '복부 아래 "와 꼬리를 핀. 각 사지 통해 앞쪽에 말까지 해부 핀을 넣으십시오.
- 집게 및 /를 사용하거나 핀을 해부하는 것은 조심스럽게 척수의 지느러미 표면을 볼 때까지 복부 방향으로 이동, 피부와 조직을 제거합니다.
- 척수의 전체 길이를 따라, 앞쪽에 방향으로 사후에 해부 핀으로 척수의 지느러미 중간선을 잘라요. 이것은 별도의 척수의 왼쪽과 오른쪽 양쪽으로 "열린 책"을 만듭니다.
- , 옆으로, 주변 조직을 제거 척수를 분리하고 지느러미 루트 신경 (DRG)를 쉽게받을 수 있습니다. 척수와 DRG 사이 해부 핀 또는 집게를 문지르고하여 DRG와 meninges을 제거합니다.
- 집게와 척수의 꼬리 - 대부분의 끝을 잡고 실험자부터 멀리 올려서하여 본문에서 척수를 제거합니다. 나머지 DRG와 meninges을 제거합니다.
- 포셉 (또는 접시에 핀)와 척수의 한쪽 끝을 잡고 척수를 이등분하는 배면의 중간선을 따라 잘라 Vannas 가위를 사용합니다.
- 조직을 고정하고 조직의 길이를 따라 작은 explants (100-500 음 길이)를 잘라 Vannas 가위를 사용하는 집게와 explant의 한쪽 끝을 잡아. 바닥 플레이트 한 explant 가장자리를 따라 조직의 명확한 농화로 인식된다.
- 0.5 ML 차가운 해부 매체와 24 잘 접시에 explants를 전송하기 위해 넓은 입을 pipet 팁을 사용합니다. 얼음 explants는 조직 생존, F를 유지하기 위해 계속또는 최대 4 시간.
4. neurite 반응을 테스트하기 위해 정화 단백질과 문화를 Explant
- 제조 업체의 지시에 따라, 얼음, 15 ML 원뿔 튜브 1.5 MG / ML 콜라겐 솔루션을 준비합니다.
- 콜라겐 솔루션 7-7.4를 사용하여 산도 표시기 종이의 산도를 가지고 있는지 확인합니다. 1 μl 권 NaOH를 추가하여 산도를 조정합니다.
- 다양한 입 pipet 팁 및 대기음 초과 액체를 사용하여 24 자 판에 explants을 전송합니다. 여러 explants 잘 하나에 교양 수 있지만, 서로 별개로 적어도 500 μm의를 배치해야합니다.
- 잘 explant를 포함하는 콜라겐의 0.5 ML을 추가합니다. 우물의 바닥 표면에 explant를 놓습니다. 콜라겐은 상온에서 중합 시작되므로 다음 잘 진행하기 전에 완전히 각 문화를 설정해야합니다.
- 콜라겐 중합에 30-45 분 ° C 슬라이드 따뜻한 37 문화 판을 놓습니다. 콜라겐은 polyme을 때그것이 젤 닮았 것입니다 rized.
- 정화 단백질 (PBS에 희석) 또는 PBS (제어) 중 하나와 함께 보충 0.5 ML 따뜻한 explant 문화 매체를 추가하고 37 품어 ° C, 5 % CO 2. neurite 가지의 효과는 24 시간으로 표시됩니다.
참고 : 42 시간 문화 SAG의 explants에 동일한 프로토콜을 사용하고 있습니다.
5. 방향 neurite의 파생물을 테스트하는 단백질 코팅 비즈와 공동 문화를 Explant
- explant 문화 단계 4.1-4.4로 시작합니다.
- pipet을 사용하여 PBS에서 잘 콜라겐 솔루션과 explant를 포함하는 1-5 비즈를 전송.
- explant의 가장자리에서 비즈 50-500 μm의 위치를 위해 집게를 사용하십시오.
- 콜라겐 중합에 30-45 분 ° C 슬라이드 따뜻한 37 접시를 놓습니다. 조직이나 비드는 콜라겐이 polymerizes로 전이 될 수 있습니다. 첫 5 분 동안 문화와 다시 위치 조직 및 구슬을 확인하십시오.
- 0.5 m 추가내가 잘하는 각각의 미디어를 SAG 24 시간 동안 품어.
6. immunohistochemistry로 neurite 가지의 시각화
- PBS의 문화를 씻어 PBS에서 4 % paraformaldehyde로 실온에서 1 시간 수정.
- 테플론 마이크로 주걱의 둥근 엔드와 젤의 가장자리 주변의 추적에 의해 우물의 벽에서 젤 풀어. 우물에서 젤로 immunostain을 수행합니다. PBS로 여러 번 씻어.
- 4 박 0.5 ML 차단 솔루션 (10 % 송아지 혈청, PBS에 0.1 % 트리톤 X - 100, 0.1 %의 나트륨 azide) ° C.에 품어
- 4 박 0.5 ML 차 항체 (항 - β - Tubulin 항체가 솔루션을 차단에 1:500 희석)에 품어 ° C.
- PBS로 여러 번 씻어. 4 박 0.5 ML 차 항체 (알렉사 형석 488 염소 안티 - 마우스 IgG 항체 2B가 1:500 희석)에 품어 ° C. 앞으로이 단계부터의 감도를 조명으로 인해 호일에 어두운 또는 포장에 접시를 유지보조 항체.
- ° C PBS에서 일주일 4에서 PBS와 저장소에 여러 번 씻어.
7. 대표 결과
그림 1. 정화 NT - 3 및 E4 여자는 SAG의 explants에서 NT - 3 - 코팅 구슬의 neurite - 촉진 효과의 대표적인 결과입니다. 신경 세포 기관 및 neurites β - Tubulin와 immunostained 및 공촛점 현미경에서 10X 목적으로 몇 군데를했다 SAG. 체외 24 시간 후, SAG의 explants 컨트롤 (1A)에 비해, NG / ML 정화 인간 NT - 3는 세포 배양 매체 (1B)에 추가 100 존재에 큰 neurite의 파생물을 표시합니다. SAG의 뉴런은 NT - 3의 포인트 소스가 로컬 neurite 가지를 홍보할 수 있습니다는 것을 입증하는 in100 NG / ML NT - 3 절어 비즈와 공동 교양되었습니다. Explants 더 표시되고 측면에 밀도 neurite 가지비드가 반대편 (1D)에 비해 및 PBS (1C)에 배어 구슬과 문화를 제어에 비해 직면 explant. 스케일 바 = 200 μm의.
그림 2. E6 병아리 척수에 정화 Wnt5a 및 Wnt5a - 코팅 구슬의 neurite - 촉진 효과의 대표적인 결과입니다. 척수의 explants는 β - Tubulin와 immunostained 및 공촛점 현미경으로 몇 군데 있었다. 정화 마우스 Wnt5a (400ng/ml), 병아리, 척수의 explants에서 neurite 가지의 존재 성장 24 시간의 증가 이후 (2B) Wnt5a (2A)없이 양식 컨트롤에 비교했다. 500 NG / ML Wnt5a에 배어 구슬은 또한 문화 (2C)를 제어에 비해 neurite 가지 (2D)를 추진하고, 척수의 explants의 가장자리 300-500 μm의 배치. 비슷한 공동 문화 결과는 이전에 다음 ID로 Wnt5a - 표현 세포 8 발표했다. 스케일 바 = 200μm의.
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토론
우리는 혈청이없는 조건에서, 병아리의, 문화 E4의 SAG와 E6 척수의 explants을 해부하다하고 방법을 제시한다. 이 절차는 현재 SAG의 신경 세포의 생존과 neurite의 파생물에 대한 다양한 분비 리간드의 효과를 연구하기 위해 연구실에서 사용됩니다. 이 프로토콜의 소설 측면 culturing의 explants와 SAG의 neurite의 파생물에 대한 효과를 연구하기 위해 성장 요인에 배어 구슬의 사용을위한 혈청없는 시스템의 사용을 포함합니다. 우리와 비슷한 비드 방법은 여자가 척수 10 설명되었습니다. 전통적으로, 구슬은 고전적인 축삭지도 요소 및 morphogens와 함께 연구에 사용되었습니다. 여기, 우리는 비드 분석도 neurite 가지 (그림 1) neurotrophins (또는 다른 성장 요소)의 효과를 조사하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났습니다.
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공개 사항
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감사의 글
이 작품은 건강 그랜트 RO1DC002756 국립 연구소와 Purdue 학술 진흥 재단에 의해 투자되었다. 우리는 실험과 수치과 관련하여 도움이 로드니의 McPhail와 조언 도리스 우와 Wiese 장 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 | 회사 | 카탈로그 번호 | 논평 |
| 장비 | |||
| 해부 현미경 | 우리는 brightfield 기본 조명과 Leica M80 stereomicroscope를 사용하여 | ||
| 따뜻한 슬라이드 | CS & E. | 콜라겐 중합 | |
| 닭고기 계란 인큐베이터 | |||
| 37 ° C / 5% CO 2 humidified 세포 문화 인큐베이터 | |||
| 해부 자료 | |||
| Sylgard &복사, 코팅 페트리 접시 | |||
| 24 물론 세포 배양 플레이트 | 코닝 | 3526 | |
| # 5 뒤몽 포셉 | 파인 과학 도구 | 11252-30 | |
| # 55 뒤몽 포셉 | 파인 과학 도구 | 11295-51 | |
| 스테인레스 해부 핀 | 파인 과학 도구 | 26002-10 | 배아 달아, 괜찮아요 해부 |
| 모리아 구멍 스푼 | 파인 과학 도구 | 10370-17 | 배아 수확 / 전송 |
| 200 μl 넓은 입 pipet 팁 | 다트 과학 Inc의 | 118 - 96R | Explant 전송 |
| E4 E6와 닭고기 달걀 | & NBSP; | ||
| 칙 울리는의 솔루션 | 배아 수확 | ||
| HBSS | 시그마 | H8264 | 절개를 SAG |
| L15 매체 | 시그마 | L5520 | 척수의 해부 매체 |
| 태아 송아지 혈청 | 애틀랜타 체액 | S11150 | 척수의 해부 매체 |
| Vannas 가위 | 세계 정밀 계측기 | 501,778 | 척수의 해부 |
| 콜라겐 준비 | |||
| 쥐 - 꼬리 콜라겐 유형 I | BD Biosciences | 354,249 | Explant 문화 |
| 10X PBS (무균) | NEU하기콜라겐 tralize | ||
| 1N NaOH (무균) | 콜라겐을 무력화 | ||
| 증류수 (무균) | 콜라겐을 무력화 | ||
| 산도 표시기 신문 (6.0-8.1) | 워트 먼지 | 2629-990 | 콜라겐 산도를 확인하려면 |
| 15 ML 원뿔 튜브 | 다트 과학 Inc의 | 818 - PG | |
| 500 μl 넓은 입 pipet 팁 | 다트 과학 Inc의 | 119 - R100 | pipet의 콜라겐하기 |
| Explant 문화 | |||
| DMEM/F12 매체 | 시그마 | D8437 | Explant 문화 매체 |
| ITS 1 | 시그마 | I2521 | 중간 보충 |
| 페니실린 - 스트렙토 마이신 | Invitrogen | 15140-122 | 중간 보충 |
| CNTF (쥐) | 시그마 | C3835 | 중간 보충 |
| NT - 3 (인간) | 시그마 | N1905 | 중간 보충 |
| 정화 마우스 Wnt5a | R & D 시스템 | 645 - WN - 010 | |
| Affi - 겔 블루 겔 비즈 | 바이오 방사선 | 153-7302 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Paraformaldehyde | 시그마 | P6148 | 정치 |
| PBS | 물에 빨고 | ||
| 트리톤 X - 100 | 시그마 | T9284 | 차단 솔루션 |
| 나트륨azide | 시그마 | S8032 | 차단 솔루션 |
| 송아지 혈청 | Invitrogen | 16170-078 | 차단 솔루션 |
| 마우스 단클론 IgG2b 방지 β Tubulin 1 + II 항체 | 시그마 | T8535 | 레이블 셀 기관 및 neurites |
| 알렉사 형석 488 염소 항 마우스 IgG2 B 항체 | Invitrogen | A21141 | β Tubulin 항체를 감지 |
| 테플론 마이크로 주걱 | VWR | 57949-033 | 우물에서 릴리스 콜라겐 젤 |
참고문헌
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