Method Article

비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

DOI:

10.3791/3609

⸱

January 14th, 2012

 ,  ,  , 
1Department of poverty related diseases, Barcelona Centre for International Health Research, 2Confocal Microscopy Unit, University of Barcelona- Scientific and Technological Centers, 3Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA)

In This Article

Summary

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우리는 GFP 형질 전환 말라리아 기생충이 장기 내에 기생충의 이동성과 혈액 흐름의 부량를 사용하여 비장의 intravital 현미경을 수행하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

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실험 쥐 모델에서 말라리아 intravital 현미경의 도래가 기생충 - 호스트 상호 작용의 1,2의 지식에 큰 발전을 허용하고 있습니다. 따라서, 사전 erythrocytic 단계 동안 말라리아 기생충의 생체내 이미징의 피부 림프절 3, 피부 4 기생충의 완전한 개발 및 마이 그 레이션을 보장하기 위해 hepatocyte - 파생 merosome의 형성에 기생충의 활성 입구를 밝혀하고있다 혈액 흐름 5로 merozoites의 릴리스. 또한 적혈구에서 개별 기생충의 개발은 최근 4D 영상을 사용하여 문서화하고 말라리아 6 단백질 수출에서 현재보기를 도전했습니다. 따라서 intravital 이미징은 크게 Plasmodium 개발의 주요 행사에 대한 우리의 견해를 변경했습니다. 불행히도, 비장, 주요 림프 기관을 통해 말라리아 기생충의 동적 통과 연구 정교하게 감염 빨간색 B 선택을 취소 적응lood 전지 기술 제약으로 인해 부족입니다.

Balb / C 마우스에서 말라리아 Plasmodium yoelii의 murine 모델을 사용하여, 우리는 비장의 intravital 이미지를 구현하고 동안 붉은 과육에 fibroblastic 원산지 장벽 세포에 차동 그것의 리모델링과 parasitized 적혈구의 준수 (pRBCs)를보고 비 치명적인 기생충 라인 P.yoelii 17X와 감염으로 P.yoelii 17XL 치명적인 기생충 라인 7 감염 반대. 이러한 결론에 도달하려면, ImageJ 무료 소프트웨어를 사용하여 특정 방법론은 단일 pRBCs의 빠른 입체 운동의 특성을 활성화하기 위해 개발되었습니다. 이 프로토콜로 얻은 결과는 비장의 기생충의 속도, 방향 및 체류 시간을 결정하는 허용, 모든 매개 변수는 생체내에 부착을 해결. 또한, 우리는 혈액 흐름 intravital 현미경을 사용하여 부량와 DIF의 사용에 대한 방법론을보고ferent 비장의 복잡한 microcirculatory 구조에 대한 통찰력을 얻기 위해 에이전트를 착색.

윤리 진술

모든 동물 연구 바르셀로나 CEEA - UB (5429 프로토콜 없음 DMAH) 대학의 동물 실험에 대한 윤리위원회의 승인 지침과 프로토콜에 따라 바르셀로나 대학의 동물 시설에서 실시되었다. 연령 6-8 주 여성 Balb / C 생쥐는 찰스 리버 연구소에서 얻은했다.

Protocol

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이 방법은 7 보고된 연구에 사용되었습니다.

1. 녹색 형광 단백질 (GFP) 형질 전환 동물 기생충과 감염

  1. 17XL과 17X의 P. yoelii - GFP 형질 전환 라인은 같은 벡터를 사용하여 전략을 타겟팅 및 프로토콜 P.에 대한 다른 설명 생성된 berghei 8. 그들은 P.의 유비 쿼터스 발기인에 따라 GFP 9 돌연변이 3 변종을 표현 전체 내부 erythrocytic 개발주기 동안 cytosol을 기생충 GFP의 제정 표현을 지휘 berghei 신장 인자 1 (Pbeef1a).
  2. P.의 parasitized 적혈구 (pRBCs)와 동물 intraperitoneally을 주사 50~10%의 parasitemia에서 기증자 마우스의 꼬리 혈액에서 얻은 및 PBS에 희석 yoelii - GFP 유전자 변형 라인 17XL 및 17X. 3 일 후 infecti 1 %의 주변 parasitemia에 도달 5x10 5 pRBCs / 마우스의 복용량을 사용하여(PI)에.
  3. 3 일 PI....

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Discussion

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이 쥐 말라리아 모델에서 비장의 intravital 현미경의 구현은 지금까지 기술적인 고려 사항에 "블랙 박스"로 인해 간주되어이 기관을 통해 기생충의 역동적인 통로를 조사 가능성을 열었습니다. 여기에서는 주요 노력은 단일 및 인구 수준에서 다른 기생충 라인의 비교 분석을 허용하는 양적 방법을 적응 넣어되었습니다. 말라리아 3,5 년 전에 이미지 있었다 다른 조직과 세포와는 달리, 비장을 통해 pRBCs의 이미징 그 출입구가 고려 장기의 세 차원과 compartmentalization와 다른 순환의 존재를 필요 빠르고 ​​느린 유량 13,뿐만 아니라 급속한 적혈구의 판매율. 이 목표로, 온라인에서 구할 수 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 특정 방법론은 populatio에서 라인 사이에 하나의 기생충 추적, 이동성 분석 및 비교를 활성화하기 위해 개발되었습니다N 수준. 그러나,이 맥락에서 하나의 기생충의 식별 및 추적을 해결 자동 소프트웨어의 응용 프로그램은 여전히​​ .......

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Disclosures

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

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우리는 A. 보쉬 (공촛점 단위, CCiT - UB, IDIBAPS)에, GFP 형질 전환 기생충을 기부에 대한 J. 화상에, 말라리아 기생충의 intravital 현미경의 초기 교육 및 지속적인 입력을위한 S. Graewe 및 V. Heussler 특히 감사 이미지 분석 및 기술 지원 부량 및 P. Astola에 도움. 우리는 R.의 Tous 및 비디오 제작을위한 I.의 Caralt 감사합니다. MF는 카탈로니아의 일반에서 졸업 교제의 수상자이다. 우연은 ICREA 연구 교수이다. 우연의 연구실에서 작업이 부여 계약 N에서 유럽 공동체의 7 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013) · 242,095, 사립 설립 연도 CELLEX (카탈로니아, 스페인)에 의해 의해 과학 및 혁신의 스페인 교육부 (재정 지원입니다 SAF2009 - 07760).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 댓글
Leica TCS - SP5 공촛점 현미경 Leica 이크로 시스템즈, 하이 델베르크, 독일 TCS - SP5 시리얼 안돼. 5100000419
케타민을 (Ketolar 50 밀리그램 / ML) 화이자 631,028
Midazolam 15 MG / 3 ML Normon 838,193
텍사스 레드로 복합 70,000 MW Dextran, 분자 프로브 D1830
플루오레신 Isothiocyanate, 이성질체 I (FITC) 시그마 F7250
Hoechst 33342 시그마 H1399
Giemsa 얼룩 시그마 GS1 작업 솔루션은 증류수에 10 %입니다
슈퍼 접착제 - 3 Loctite Loctite 9975-0880

References

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  1. Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites--recent advances and future directions. Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).
  2. Heussler, V., Doerig, C. In vivo imaging enters parasitology. Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).

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Intravital MicroscopySpleen ImagingParasite MobilityBlood Flow QuantificationPlasmodium yoeliiGFP Transgenic ParasitesConfocal MicroscopyImageJ AnalysisRed Pulp DynamicsVessel Cannulation

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