방법 논문

도구로 상호 빛과 전자 현미경 (클레멘 타인)는 Microinjected 분자와 진핵 세포 하위 세포 목표를 시각화하는 방법

DOI:

10.3791/3650

⸱

2012년 5월 4일

 , 
1Department of Molecular Microbiology, University of Texas Southwestern Medical Center

이 논문에서

요약

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클레멘 타인 기술은 microinjected 분자에 의해 영향을 멤브레인, 세포 소기관, 그리고 subcellular 구조 ultrastructural 형태를 분석하도록 구성되었습니다. 이 방법은 다중 나노 미터 해상도 밀리미터 수 있도록 미세 조작 / microinjection의 강력한 기술, 공 촛점 형광 현미경 및 전자 현미경을 자랑합니다. 이 기술은 응용 프로그램의 다양한 의무가 있습니다.

초록

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진핵 세포는 복잡한에 의존 높은 규제하고, 적절한 세포 기능에 필요한 생화학 극성을 보존 기능 뚜렷한 막 바인딩 된 구획. 효소, 단백질, 그리고 cytoskeletal 부품이 생화학 분리를 적용하고 유지하는 방법을 이해하는 것은 파라마운트 중요성을 따라서입니다. 휘황 태그 분자의 사용 또는 교란 subcellular 구획은 풍부한 지식이 나왔고 및 셀룰러 규제에 대한 우리의 이해를 전진했다와 / 현지화입니다. 이러한 형광 및 공 촛점 현미경 등의 이미징 기술은 비교적 간단 휘황 태그 작은 분자의 위치를 ascertaining 수 있도록 매우 작은 구조 그러나 해상도는 1 제한됩니다.

한편, 전자 현미경은 매우 높은 해상도로 subcellular 형태의 세부 사항을 발표했다 있지만 정적 자연은 어려운 매우 동적 프로를 측정 할 수 있습니다정밀도 2,3와 cesses. 따라서, 동일한 샘플의 전자 현미경, 칭했다 상호 빛과 전자 ​​현미경 (클레멘 타인) 4,5과 빛 현미경의 조합은, 전자 현미경 6 높은 해상도로 ultrafast 형광 이미징의 듀얼 장점을 갖게. 이 강력한 기술은 세포 생물학 5,7의 여러 측면을 연구 구현되었습니다. 처음 소개 된 이래,이 절차는 높은 해상도의 subcellular 구조와 morphologies를 구별 할 수있는 능력을 향상 시켰습니다.

여기, 우리는 클레멘 타인 (그림 1) 다음 빠른 microinjection을 수행하기위한 간소화 된 방법을 제시한다. microinjection의 클레멘 타인 절차는 직접 진핵 세포 세포질에 작은 분자 및 / 또는 단백질의 특정 수량을 소개하고 (그림 2) 멀티 나노 미터 해상도 mm의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 기술은 microinjecting을 기반으로합니다세포는 모두 공 촛점 형광 및 전자 현미경과 라이브 셀 요리와 이미지의 하단에 부착 레이저 에칭 유리 gridded coverslips에 성장. 관심 세포의 현지화 (들) 쉽게 (그림 3) 시료의 고정에 사용되는 Epon 수지에 이르기까지 관심의 세포와 함께 양도 및 이전 전자 현미경 분석에 sectioning되는 격자 패턴에 의해 촉진된다. 형광 및 EM 이미지의 중첩은 사용자가 subcellular 지방화뿐만 아니라 관심 microinjected 분자 (그림 4)에 의해 유도 된 형태학 및 / 또는 ultrastructural 변경 사항을 확인할 수 있습니다. 이 기술은 microinjected 샘플의 특성에 따라 몇 시간이 ≤에서 5 초를 이르는 시간이 가리키는 의무가 있습니다.

프로토콜

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1. 포유류의 세포 배양

  1. 일반 쥐 신장 (NRK)는 (모든 시약에 대해 표 1를 참조하거나 셀 요리를 살고 부착 photoetched 유리 gridded coverslips에 자궁 경부암 (헬러), 또는 기타 적절한 포유류의 세포 라인 37 배양 아르 ° C, 5 % CO 2, 불후의 장치 DMEM + 10% FBS에)이 프로토콜에 사용하고 1% 펜 / 패 혈성. 주의 사항은 양식 포유류의 세포와 함께 작업 할 때 무균 환경을 유지하기 위해주의해야한다.
  2. 실험 시간 선 (0~5시간 대 1~2일의 포스트 분사)에 따라 세포의 confluency는 ~ 50 %로 조정하거나 각각 25 % ~해야한다.

2. Microinjection

  1. ~ 50 μl의 최종 볼륨에, 세포 문화의 복종 할 의무에 따라, 버퍼의 선택 원하는 단백질, DNA, 또는 작은 분자를 준비합니다. 이러한 텍사스 레드, 캐스케이드 블루 등의 불활성 형광 염료microinjected 셀을 표시하기 위해 포함되어 있습니다, 사출 염료 및 형광 프로브의 선택은 겹치지 여기와 방출 파장이 있어야합니다. microinjection에 필요한 관심 분자의 농도는....

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토론

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여기에 제시된 방법은 진핵 세포 세포질에 정화 단백질, 핵산, 또는 작은 분자의 직접 전송을 할 수 있으며 형광 및 전자 현미경의 상관 관계를 통해 초 고해상도 분석을 갖게. 이 방법의 사용은 단순하지만 강력한이 많은 기존의 핵심 시설 및 / 또는 적절하게 구비 전자 현미경 실험실와 함께 집에서 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 사용자가 실시간으로 휘황 태그 분자의 역학을 모니터링 할 수 있으며 따라서 시간 경과 현미경과 함께 사용 단층 전자 현미경에 상관 할 수 있도록 라이브 셀 의무가 있습니다.

예비 경험적 실험은 전자 micr에 대한 최적의 confluency, microinjection 효율과 injectant, fluorophores의 최적화 및 사출 / 염료 (들)을 추적의 적절한 수량의 전달, 가용성 및 / 또는 전문 지식을 결정하기 위해 실험의 모든 단계에서 실시되어야한다oscopy 분석. 클레멘 타인 절차의 모든 단계에서 주입 셀을 찾기이 프로토콜에 중요하다,.......

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공개 사항

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관심의 충돌이 선포되지 않습니다.

감사의 글

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우리는 도움이 토론의 알토 연구소의 회원 감사드립니다. 우리는 또한 기술적 인 전문 지식과 조언을 UT 남서 의료 센터, 특히 박사 크리스 Gilpin, 톰 Januszewski, 그리고 로리 뮬러에서 분자 및 세포 이미징 시설 감사드립니다. 우리는 또한 원고의 중요한 읽기에 대한 박사 Xionan 동 감사드립니다. 이 작품은 NMA에 NIH 보조금 AI083359에서 지원

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트
Photoetched Coverslip와 라이브 셀 플레이트 MatTek P35G-2-14-CGR​​D
텍사스 레드 Invitrogen D3329
캐스케이드 블루 Invitrogen D7132
Rhodamine 라벨 키트 열 과학 53,002
0.22 μm 원심 여과 장치 Millipore UFC30GV00
붕규산 유리 피펫 셔터 악기 BF100-50-10
Micropipette 풀러 셔터 악기 모델 P-97 램프 테스트를 수행 한 후에는 프로그램을 # 4를 사용
FemtoJet의 Microinjection 시스템 Eppendorf Injectman NI2
Coverslip 제거 유체 MatTek PDCF OS 30
Technai 전송 전자 현미경 페이 Technai G2 BioTWIN
Ultramicrotombe Leica EM UC6

참고문헌

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  1. Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. Advances in microscopy techniques. Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).
  2. Giepmans, B. N. Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy. Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).
  3. Mayhew, T. M.,....

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