이 비디오 프로토콜 유동세포계측법 기술을 사용하여 물리적 (크기 및 내부 단위) 및 형광 특성을 바탕으로 신경 줄기 세포의 재생 소스 (NSCs)에서의 연결 전구 세포의 생성과 이후의 정화를위한 소설 방법을 보여줍니다.
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방법 논문
Neuroblast 분석 : 유동세포계측법을 사용하여 차별화 신경 줄기 세포에서 자손의 연결 전구 세포의 생성과 강화에 대한 분석
이 논문에서
요약
초록
신경 줄기 세포 (NSCs)에 격리하고 확장 가능한 대규모 neurosphere 분석을 사용하고 중추 신경계 (CNS)의 세 가지 주요 세포 유형으로 차별, 즉, astrocytes, oligodendrocytes과 뉴런. 이러한 특성은 신경 줄기 및 전구 세포와 같은 약물 검사, neurotoxicology 및 전기 생리학 등의 체외 연구와 또한 많은 신경 질환에서 세포 대체 요법에 대한 대한 세포의 귀중한 재생 소스를 확인합니다. 그러나 실제로 NSC의 자손, 뉴런과 oligodendrocytes의 낮은 생산, 차별화 자신의 임상 응용 프로그램을 제한하는 다음과 같은 astrocytes의 우위의 이질. 여기서는 형광 활성 세포 정렬 (FACS) 기술을 이용한 murine NSC의 자손에서 미숙 뉴런의 생성 및 그 이후의 정화를위한 소설 방법론을 설명합니다. 이 방법론을 사용하여, 매우 풍부의 연결 전구 세포 인구는 지혜를 얻을 수어떠한 눈에 띄는 astrocyte와 타고난 NSC 오염을 슬프게도 인류. 절차는 NSC의 자손 격리 및 유동세포계측법 기술을 사용하여 물리적 (크기 및 내부 복잡성) 및 형광 특성을 바탕으로 미숙의 연결을 세포의 분리와 농축 다음 neurosphere 분석을 사용하여 E14 마우스 ganglionic eminences에서 확장의 분화를 포함합니다. 전반적으로, 그것은 NSC의 자손을 차별화하는 데 neurospheres 및 6~8일를 생성하는 5~7일 걸리며 매우 미숙의 연결 세포를 정화 분리.
프로토콜
1. Basic은 세포 배양을하기 전에 설정
- NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간 및 NeuroCult NSC 확산 보충제는 전체 NSC 매체를 만들기 위해, 각각 9시 1분 비율로 섞여있다.
- 37 ° C의 물 목욕은 매체를 워밍업하는 데 사용됩니다.
- 더위 inactivated 소태아 혈청 (FCS)의 적절한 금액은 해동됩니다.
- 표피 성장 인자 (10 μg / ML에서 EGF), 기본 fibroblastic 성장 인자 (10 μg / ML에서 B-FGF)와 인산의 0.2 % 헤파린 용액을 포함하여 주식 성장 인자 솔루션의 적절한 양은 염분이 (PBS) 해동되는 버퍼.
- 조직 문화 flasks (T25, T75 또는 & T175)은 NSC 확장과 분화를 위해 필요합니다.
- 조직 문화는 96와 24도 접시를 취급하고 유리 coverslips는 정렬된 세포를 도금을 위해 필요합니다.
2. NSCs의 분리 및 확장 (Passaging)
- 신경 줄기와 progenitors은 생쥐 B로부터 격리되고 확장되는별도의 프로토콜을 1, 2, 3에서 설명된대로 비가.
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토론
정의된 신경 세포 인구를 분리하는 기능 (즉, 뉴런, astrocytes와 oligodendrocytes)은 신경 줄기 세포의 임상 응용 (NSCs)와 관련된 방해물의 일부를 해결할 수 있습니다. 첫째, 완전히 기증자 세포의 시작 인구 특성을 우리에게 있습니다. 둘째, 우리가 질병의 특성이나 무대 상황에 따라 특정 비율로 특정 세포 유형 또는 다른 세포 유형의 조합을 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 매우 풍부한 사전 차별화된 신경 세포 progenitors를 사용하여 획기적으로 가능한 통제 확산과 타고난 NSC 6을 포함하는 이기종 신경 엽 성의 전구 물질을 사용하여 연관된 종양 형성을 줄일 수 있습니다. 일반적으로 신경 줄기 세포의 분화가 5~10%의 연결을 세포 80 % 이상의 astrocytes가 높아집니다. 분화의 프로 농구 (NBA) 메서드를 사용하여의 연결을 세포의 비율 20-30%까지 증가했지만 여전히 astrocytes 많이와 다른 줄기와 P가 없습니다하나가 체외에서 순수의 .......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
이 작품은 Overstreet 재단에서 기금에 의해 지원되었다.
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재료
| 시약의 이름 | 유형 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간 | 매질 | 셀 기술을 막기 | 05,700 | |
| NeuroCult NSC 확산 보조 | 중간 보충 | 셀 기술을 막기 | 05,701 | |
| 0.05 % 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | 시약 | Gibco | 25300-062 | |
| 대두 트립신 억제제 | 시약 | 시그마 | T6522 | |
| 펜 / Strep | 시약 | Gibco | 15140-122 | |
| * MEM | 시약 | Gibco | 41500-018 | 앙 구성 요소 |
| * HEPES | 시약 | 시그마 | H4034 | 앙 구성 요소 |
| * 증류수 | 시약 | Gibco | 15230-147 | |
| 셀 스트레이너 | 체 | BD 팔콘 | 352,340 | |
| T25 플라스크 | 문화 도자기 | Nalge Nunc 인터내셔널 | 136,196 | |
| T80 플라스크 | 문화 도자기 | Nalge Nunc 인터내셔널 | 178,905 | |
| 15 ML 튜브 | 문화 도자기 | BD 팔콘 | 352,096 | |
| 50 ML 튜브 | 문화 도자기 | BD 팔콘 | 352,070 | |
| EGF | 성장 인자 | R & D | 2028-EG | |
| B-FGF | 성장 인자 | R & D | 3139-FB | |
| 헤파린 | 성장 인자 | 시그마 | H4784 | PBS로 재구성 |
| 안티 - PSA-NCAM-PE | 항독소 | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE-복합 마우스 IgG1 | Isotype 제어 항체 | BD Pharminogen | 556,029 | |
| 헤파린 | 성장 인자 | 시그마 | H4784 | PBS로 재구성 |
| HrBMP-4 | 성장 인자 | R & D | 314-BP-010 | |
| 폴리-L-Ornithine | 시약 | 시그마 | P4957 | |
| 소태아 세럼 | 중간 보충 | Gibco | 10099-141 | |
| GFAP | 항독소 | DAKO | Z0334 | |
| B-III의 tubulin | 항독소 | Promega | G7121 |
* 앙, 믹스 1 X MEM 10 패 패킷 및 1M HEPES 160 ML을하고 증류수를 사용하여 8.75 L로 볼륨을 이끌 것이다. 7.4로 최종 PH를 설정 및 4 ° C.에 보관
참고문헌
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393(2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse....
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