이 비디오 프로토콜 유동세포계측법 기술을 사용하여 물리적 (크기 및 내부 단위) 및 형광 특성을 바탕으로 신경 줄기 세포의 재생 소스 (NSCs)에서의 연결 전구 세포의 생성과 이후의 정화를위한 소설 방법을 보여줍니다.
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방법 논문
Neuroblast 분석 : 유동세포계측법을 사용하여 차별화 신경 줄기 세포에서 자손의 연결 전구 세포의 생성과 강화에 대한 분석
이 논문에서
요약
초록
신경 줄기 세포 (NSCs)에 격리하고 확장 가능한 대규모 neurosphere 분석을 사용하고 중추 신경계 (CNS)의 세 가지 주요 세포 유형으로 차별, 즉, astrocytes, oligodendrocytes과 뉴런. 이러한 특성은 신경 줄기 및 전구 세포와 같은 약물 검사, neurotoxicology 및 전기 생리학 등의 체외 연구와 또한 많은 신경 질환에서 세포 대체 요법에 대한 대한 세포의 귀중한 재생 소스를 확인합니다. 그러나 실제로 NSC의 자손, 뉴런과 oligodendrocytes의 낮은 생산, 차별화 자신의 임상 응용 프로그램을 제한하는 다음과 같은 astrocytes의 우위의 이질. 여기서는 형광 활성 세포 정렬 (FACS) 기술을 이용한 murine NSC의 자손에서 미숙 뉴런의 생성 및 그 이후의 정화를위한 소설 방법론을 설명합니다. 이 방법론을 사용하여, 매우 풍부의 연결 전구 세포 인구는 지혜를 얻을 수어떠한 눈에 띄는 astrocyte와 타고난 NSC 오염을 슬프게도 인류. 절차는 NSC의 자손 격리 및 유동세포계측법 기술을 사용하여 물리적 (크기 및 내부 복잡성) 및 형광 특성을 바탕으로 미숙의 연결을 세포의 분리와 농축 다음 neurosphere 분석을 사용하여 E14 마우스 ganglionic eminences에서 확장의 분화를 포함합니다. 전반적으로, 그것은 NSC의 자손을 차별화하는 데 neurospheres 및 6~8일를 생성하는 5~7일 걸리며 매우 미숙의 연결 세포를 정화 분리.
프로토콜
1. Basic은 세포 배양을하기 전에 설정
- NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간 및 NeuroCult NSC 확산 보충제는 전체 NSC 매체를 만들기 위해, 각각 9시 1분 비율로 섞여있다.
- 37 ° C의 물 목욕은 매체를 워밍업하는 데 사용됩니다.
- 더위 inactivated 소태아 혈청 (FCS)의 적절한 금액은 해동됩니다.
- 표피 성장 인자 (10 μg / ML에서 EGF), 기본 fibroblastic 성장 인자 (10 μg / ML에서 B-FGF)와 인산의 0.2 % 헤파린 용액을 포함하여 주식 성장 인자 솔루션의 적절한 양은 염분이 (PBS) 해동되는 버퍼.
- 조직 문화 flasks (T25, T75 또는 & T175)은 NSC 확장과 분화를 위해 필요합니다.
- 조직 문화는 96와 24도 접시를 취급하고 유리 coverslips는 정렬된 세포를 도금을 위해 필요합니다.
2. NSCs의 분리 및 확장 (Passaging)
- 신경 줄기와 progenitors은 생쥐 B로부터 격리되고 확장되는별도의 프로토콜을 1, 2, 3에서 설명된대로 비가.
- neurospheres이 (중 기본 또는 passaged neurospheres) subculture (직경 150-200 μm의)에 대한 준비가되면, 매체 포함된 분야는 적당한 크기로 무균 조직 배양 튜브에 양도하고, 5 분 800 RPM (110g)에 centrifuged합니다 상온에서.
- 뜨는 매체가 제거되고 분야는 미리 예열 0.05 % 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 중 1 ML에서 다시 정지됩니다.
- 2-3 분 37 ° C 물 목욕의 인큐베이션 후, 대두 트립신 억제제의 동일한 볼륨은 트립신 활동을 중지 세포 현탁액에 추가됩니다.
- 트립신 완전히 inactivated되었는지 확인하려면 세포 현탁액이 부드럽게 내려 3-5 시간을 pipetted하고있다.
- 5 분, 800 RPM (110g)에서 원심 분리 후, 표면에 뜨는이 제거되고 세포는 전체 NSC 매체의 1 ML에서 다시 정지됩니다.
- 세포 현탁액의 10μl는 trypa 90 μl와 혼합되어N 파란색은 셀 카운트를 수행합니다.
참고 : 기타 적절한 셀 dilutions도 사용할 수 있습니다. - 아래 설명된 바와 같이 세포 그때 subculture 1, 2 또는 차별 화를 위해 사용됩니다.
3. 신경 줄기 및 전구 세포의 분화, Neuroblast 분석 (NBA)
- dissociated neurospheres에서 발생하는 세포는 20 NG / ML EGF, 10 NG / ML bFGF, 0.2 % 헤파린의 1 μl / ML 및 5 %로 보완 완료 NSC 매체에서 2-3 × 10 5 세포 / ML의 농도에 도금되어 더위가 적절한 크기의 조직 배양 플라스크에 FCS를 inactivated. 5 ML 매체는 T75을위한 T25, 20 ML 및 T175 flasks 40 ML에 사용됩니다.
참고 : FCS는 세포가 단단히 기판에 부착시킬 수 있으며 NBA 문화를위한 코팅 flasks을위한 필요가 없습니다. - 예찬우레의 flasks 그러면 3-4일을위한 5 % CO 2와 37 ° C humidified 인큐베이터에 incubated됩니다. 이 기간은 NSC의 자손이 기판에 부착하고 세포 단일층로 분아 따위에 의해 번식하는 동안은 증식 단계라고합니다.
- 문화 90-95%에 합류, 각 플라스크의 중간이되면 어떤 성장 요인없이 5% FCS와 보완 완료 NSC 매체로 전환됩니다.
- 문화 flasks 다시 다른 3~4일을위한 5 % CO 2와 37 ° C humidified 인큐베이터에 incubated됩니다. 이 기간의 연결을 progenitors은 astrocytic 단일층 상단에 표시하고 미숙의 연결을 세포의 콜로니를 만들기 위해 분아 따위에 의해 번식하는 동안, 분화 단계라고합니다. 분화 단계의 날이 4-5 일, 문화 유동세포계측법 기술을 사용하여 neuroblast 전지의 절연을위한 준비가되었습니다.
4. 유동세포계측법위한 셀 준비
Trypsinization
- 분화 단계의 날이 4-5에서 NSC의 자손을 차별 문화는 문화에서 FCS를 제거하는 PBS의 적절한 금액 (T25 2 ML, T75 4 ML과 T175 플라스크 8 ML)으로 한번 씻어있다.
참고 : FCS 블록 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 활동. - 그런 다음 미리 예열 0.05 % 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (T25 2 ML, T75 4 ML과 T175 플라스크 8 ML)의 충분한 양의는 세포 단일층을 충당하기 위해 각 플라스크에 추가에서 1-2 분 동안 incubated합니다 37 ° C humidified 인큐베이터.
- 플라스크는 문화에 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 효과를 평가하기 위해 현미경으로 검사합니다. 플라스크 그런 다음 한손으로 개최하고 플라스크의 바닥으로부터 세포를 꺼내려 다른 손으로 단단히 빠진있다.
- 대두 트립신 억제제의 평등 볼륨은 트립신 활동을 끄지하기 플라스크에 추가됩니다. 세포 현탁액은 부드럽게 트립신 불활 성화를 보장하고 동질적인 하나의 세포를 달성하기 위해 아래로 pipetted되고정지.
참고 : 또는 5 % FCS와 보완 매체가 트립신 활동을 끄지하는 데 사용할 수 있습니다. - 비 dissociated 대단히 짧은 시간을 제거하려면 세포 현탁액은 40 μm의 크기의 메쉬 필터를 통해 전달됩니다.
- 세포 현탁액 그때 5 분, 800 RPM (110g)에 centrifuged 있으며, 표면에 뜨는이 제거되고 세포는 전체 NSC 매체의 적절한 볼륨으로 다시 정지됩니다.
- 세포 현탁액의 최종 볼륨은 세포 밀도가 2-3x10 6 -cells/ml를 초과하지 않도록 조정됩니다. 높은 세포 밀도는 유동세포계측법 기계에서 스트림 차단을 일으킬 수 있습니다.
- 방금 그들의 물리적 특성에 기초의 연결 세포를 분리하고자 할 경우, 이제는 4 부의 설명에 따라 분류 FACS로 진행할 수 있습니다.
- 정렬하기 전에 Propidium의 요오드화물은 (PI, 시그마, PBS 500 μg / ML) 1 μl / 죽은 세포를 제외할 세포 현탁액의 ML의 농도에 추가됩니다.
cel 라이브리터 immunolabeling
높은 프로 농구 (NBA)의 문화에서 하나의 세포를 수확의 연결을 세포의 순도, PSA-NCAM (초기 미숙의 연결을 progenitors의 마커) 다음의 연결 인구에서 긍정적인 세포에 대한 물들일 수를 달성하기 위해서는 FACS 기계를 사용하여 격리 수 있습니다.
- 셀 카운트를 수행한 후에는 NBA 문화에서 단일 세포 현탁액은 네 그룹으로 나뉘어져 있습니다 :
- 혼자 셀 그룹은, 매개 변수 및 성문 (0.5-1 X 10 6 셀)를 조정하는 제어 역할을합니다.
- 셀 플러스 PI는 매개 변수 및 성문 (0.5-10 × 10 6 셀)를 조정하는 제어 역할을합니다. 이 그룹의 PI 부정적인 세포는 세포가 물리적 특성에 따라도 정렬할 수 있습니다.
- 또한, 매개 변수 및 성문 (1-2 X 10 6 셀)를 조정하는 제어 역할을 보조 혼자 (Isotype 제어) 그룹.
- 달성하기 위해 PSA-NCAM에 대한 물들어있는 Immunolabeling 그룹 (8-10 X 10 6 셀)미숙 세포의 연결을 더욱 정화. 정렬시 죽은 세포를 제외하려면 PI는뿐만 아니라이 그룹에 추가됩니다.
- immunolabeling를 시작하려면 전지는 5 분, 800 RPM (110g)에 centrifuged됩니다. 표면에 뜨는이 제거되고 세포는 전체 NSC 매체의 100 μl에 다시 정지됩니다.
- Phycoerythrin (PE) 복합 백신 PSA-NCAM 항체는 PSA-NCAM에 대한 물들일 수있는 세포 현탁액에 10월 5일부터 10일까지 / μl X 10 6 세포의 비율에 추가됩니다. 마찬가지로 PE 복합 마우스 IgG1 isotype 제어 항체는 isotype 제어 세포 현탁액에 추가됩니다. 사용되는 항체의 농도에 관한 항체 사양서에 지시를 따릅니다. 세포 현탁액 그런 다음 부드럽게 섞어 어둠 속에서 10-15 분 동안 상온에서 incubated합니다.
- 세포 현탁액 (PSA-NCAM 및 Isotype 제어 튜브)이 후 5 분 800 RPM (110g)에 centrifuged하고 뜨는이 제거되고 세포가 다시 suspe 수있다는전체 NSC 매체의 1 ML에 nded.
- 샘플에서 과잉 취소 묶여 항체를 제거하려면 단계 4는 3 배 더 반복한다.
- 후 다시 정지 Propidium의 요오드화물은 (PI, 시그마, PBS 500 μg / ml) 쇼핑 세포 현탁액 1 μl / ML (세포 플러스 PI, isotype 제어 및 농도에 추가됩니다 매체의 적절한 볼륨으로 세포를 PSA- 유동세포계측법에 의해 분석하면 NCAM 묻은 샘플)는 죽은 세포를 제외합니다.
- 전체 매체 중 1 ML을 포함하는 15 ML 멸균 팔콘 튜브는 다른 세포 집단에서 정렬된 세포를 수집할 준비가되어 있습니다.
5. 미숙 뉴런의 형광 - 활성 셀 정렬 (FACS)
- FACS 기계는 유동세포계측법 시설 전문 기술자를 통해 자사의 사용자 설명서 지침을 기반으로 설정됩니다.
- 인산염은 식염수 (PBS) 또는 다른 적절한 솔루션 dependin 버퍼제조 업체 지침에 g는 90 μm의 노즐을 통해 28 PSI에 칼집 유체로 사용할 수 있습니다.
- 시스템의 차동 압력이 정렬 트리거 속도가 2500 이벤트 / 초를 초과하지 않는 등 조정됩니다.
- 혼자 세포의 세포 현탁액이 그룹은 FACS 기계를 통해 실행됩니다.
- 첫째, 세포가 (이벤트)의 크기 (전방 산포도 (FSC) 빛) 대 다른 세포 집단을 구분하기 위해 내부 복잡도 (사이드 산포도 (SSC) 빛)을 기반으로 꾸몄다됩니다. 이렇게하려면 FSC와 SSC를위한 전압 매개 변수가 세포 유동세포계측법 계획에서 볼 수 있도록 조정되어야한다.
- 세포 대단히 짧은 시간과 doublets를 제외하려면 세포가 먼저 앞으로 분산형 지역 (FSC-) 대 순방향 산란 펄스 폭 (FSC-W) 및 단일 세포 인구가 인구 1 (P1)와 같은 문이있다 토대로 꾸몄다됩니다. 그렇다면 P1 전지 사이드 분산형 지역 (SSC-) 대 사이드 분산형 펄스 폭 (FSC-W) 및 단일 세포 gat있는이 시간을 기준으로 꾸몄다있다인구 2 (P2)로 에드. 이 두 연속 게이트, 대단히 짧은 시간 또는 doublets을 (높은 FSC 펄스 폭 및 높은 SSC 펄스 폭) 설립하는 것이 배제되고있다.
- 죽거나 손상된 세포를 제외하려면 하나의 세포는 (P2) FSC-A와 하나의 살아있는 세포 인구 문이입니다 대 PI의 반응을 바탕으로 꾸몄다됩니다.
- 싱글 라이브 세포는 세포의 크기와 내부 단위에 따라 서로 다른 세포 집단을 구분하는 FSC 대 SSC를 기반으로 꾸몄다됩니다. 이 단계에서는 두 가지 세포 인구는 FSC 낮은 SSC 낮은 (P3)와 FSC 높은 SSC 고등학교 (P4) 세포 집단과 같은 문이 있습니다.
- 정렬하려면 FSC 낮은 SSC 낮은 인구에서 PSA-NCAM은 immuno-반응성 미숙의 연결을 세포, 컨트롤에서 먼저 FSC 낮은 SSC 낮은 인구 (플러스 PI 및 isotype 제어 세포) 그룹은 FSC-비해 체육 immunoreactivity을 기반으로 꾸몄다과 부정적이다 세포는 (P5) 문이 있으며, PSA-NCAM에서 다음 긍정적인 세포스테인드 그룹은 인구 6 (P6)와 같은 문이 있습니다.
- 모든 필요한 성문을 조정 후 이익의 세포는 1ml NSC 매체를 포함하는 15 ML 무균 조직 배양 튜브로 정렬됩니다.
- 정렬 세포 후 5 분 위해 1200 RPM (240g)에 centrifuged됩니다.
- 뜨는 폐기되고 펠렛이 수행되는 중간 (펠렛의 크기에 따라)와 셀 카운트의 적절한 볼륨으로 다시 일시 중지되었습니다.
- 셀 그때 5퍼센트 FCS 20 NG / ML 인간 재조합 BMP4 5 20-30 X 10 3 셀 밀도 / 잘 완전한 NSC 매체 200-250 μl시 폴리-L-Ornithine 코팅 96 - 웰 플레이트에 도금되어 .
참고 : 코트 96 우물, 폴리-L-Ornithine 작업 솔루션을 100 μl를로 (1.5 ML 폴리-O 및 멸균 PBS의 8.5 ML) 각도에 추가되고 판은 최소한 하나에 대해 37 ° C 배양기에서 incubated합니다 시간. 그런 다음, 멸균 PBS로 폴리-O가 제거되고 각각 아니라는 세 번 씻어있다(PBS가 10 분 동안 우물에 매번 유지하자). 폴리-L-Ornithine이 / 잘 24도 접시를 사용하는 경우 해결책을 일하고 500 μl를 사용하십시오.
- 셀 그런 다음 정렬 차가운 4 % paraformaldehyde를 사용하면 다른 시간 지점에 고정하고 다른 세포 집단에서 정렬 세포의 표현형을 평가하기 위해 적절한의 연결 및 glial 세포 마커를 위해 immunostained됩니다.
6. 대표 결과
neuroblast 분석 (NBA) 차별 문화에서 도금 세포는 조직 배양 기판에 연결하고 단일층로 성장. 초기 셀 도금 밀도에 따라 문화 3-4 일 후에 90~95% 합류 문화로 돌아갈 것입니다. 이 단계에서는 주로 astrocytic 세포 단일층는 최고 4,5에 작은 원형의 연결 전구 세포 (그림 1)과 시각 아래가 될 수 있습니다. 성장 인자 무료 매체 매체를 전환 후의 연결 전구 세포가 시작급속하게 나누어와 4-5일의 astrocytic 단일층 (그림 2)의 꼭대기에서 미숙 neuroblast 세포의 클러스터를 생성합니다. 셀 크기 (FSC)와 내부 단위 (SSC) (그림 3)을 기반으로 FSC 낮은 SSC 낮은 FSC 높은 SSC 높은, 분화 단계의 4~5일에 dissociated 프로 농구 (NBA) 문화의 유동세포계측법 분석은 두 가지 세포 인구를 보여줍니다. FSC 높은 SSC 높은 인구에서 정렬 세포가 주로있는 동안 정렬된 세포 Immuno-형광 분석,의 연결 세포는 주로 FSC 낮은 SSC 낮은 인구 (그 이상의 75 % β-III의 tubulin을 표현 포함)에 위치하고 있는지 보여줍니다 immunoreactive astrocytes를 (그림 4) GFAP. 최대 근처의 균질성 (97 %)로 미숙 세포의 연결을 추가 정제는 FSC 낮은 SSC 낮은 인구 (그림에서 PSA-NCAM IR 전지의 긍정적인 선택을 구현할 수3, 4). E14 마우스 ganglionic eminences 격리 NSCs에서 생성된 농축의 연결 세포는 분화시 GABAergic 표현형 표현 DARPP-32, 매체 가시의 뉴런의 마커 (그림 5)를 취득.
확산 단계의 날이 4 E14 마우스 신경 줄기 세포에서 그림 1. Neuroblast 분석 문화. 이 단일층 문화는 플랫 astrocytic 세포 (화살촉) 아래와 위에 원형의 연결 전구 세포 (화살표)으로 구성되어 있습니다. 원래 배율, 20 X.
) 위상 대조, B) Immunofluorescent 염색법 :. 분화 단계의 날이 4 E14 마우스 신경 줄기 세포에서 그림 2 Neuroblast 분석 문화. 미숙의 연결 세포 (의 클러스터를 적어 둡니다의 화살 (B에, GFAP의 염색법의 화살표 머리) 위에 B의>와 β III의 tubulin의 염색법). 원래 배율, 20 X.
. 그림 3 대표 정렬 플롯 :). FSC 대 doublets과 죽은 세포를 배제하기 전에 SSC 정렬 줄거리. B, C). FSC와 SSC 펄스 폭. D를 기반으로 doublets의 제외 정렬 플롯). 죽어서 손상된 세포를 제외 Propidium 요오드화물의 immunoreactivity에 기초. E는). doublets과 죽은 세포를 배제 후 FSC 대 SSC는 플롯, FSC 낮은 SSC 낮은 FSC 높은 SSC 높은 인구로 표시된 두 가지 주요 인구를 보여주는. F, G). 정렬 플롯은 FSC 낮은 SSC 낮은 인구에서 PSA-NCAM IR 미숙 세포를 분리합니다.
세포에서 그림 4. 대표 micrographs은 도금 후 다른 집단에서 하루 정렬.) FSC 낮은 SSC 낮은 인구 (이들 세포가 뉴런있는 이상의 75 %). B) FSC 높은 SSC 높은 인구 (이들 세포의 대부분은 astrocytes 있습니다 ). C) PSA-NCAM FSC 낮은 SSC 낮은 인구 (거의 모든 정렬된 세포는 뉴런이다)에서 + 정렬 세포. 원본 확대, 20 X.
그림 5. 정렬 미숙 뉴런은 GABAergic 뉴런 ()와 표현 DARPP-32 (B), 중간 가시 뉴런을위한 표지로 구분.
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토론
정의된 신경 세포 인구를 분리하는 기능 (즉, 뉴런, astrocytes와 oligodendrocytes)은 신경 줄기 세포의 임상 응용 (NSCs)와 관련된 방해물의 일부를 해결할 수 있습니다. 첫째, 완전히 기증자 세포의 시작 인구 특성을 우리에게 있습니다. 둘째, 우리가 질병의 특성이나 무대 상황에 따라 특정 비율로 특정 세포 유형 또는 다른 세포 유형의 조합을 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 매우 풍부한 사전 차별화된 신경 세포 progenitors를 사용하여 획기적으로 가능한 통제 확산과 타고난 NSC 6을 포함하는 이기종 신경 엽 성의 전구 물질을 사용하여 연관된 종양 형성을 줄일 수 있습니다. 일반적으로 신경 줄기 세포의 분화가 5~10%의 연결을 세포 80 % 이상의 astrocytes가 높아집니다. 분화의 프로 농구 (NBA) 메서드를 사용하여의 연결을 세포의 비율 20-30%까지 증가했지만 여전히 astrocytes 많이와 다른 줄기와 P가 없습니다하나가 체외에서 순수의 ...
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
이 작품은 Overstreet 재단에서 기금에 의해 지원되었다.
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재료
| 시약의 이름 | 유형 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간 | 매질 | 셀 기술을 막기 | 05,700 | |
| NeuroCult NSC 확산 보조 | 중간 보충 | 셀 기술을 막기 | 05,701 | |
| 0.05 % 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | 시약 | Gibco | 25300-062 | |
| 대두 트립신 억제제 | 시약 | 시그마 | T6522 | |
| 펜 / Strep | 시약 | Gibco | 15140-122 | |
| * MEM | 시약 | Gibco | 41500-018 | 앙 구성 요소 |
| * HEPES | 시약 | 시그마 | H4034 | 앙 구성 요소 |
| * 증류수 | 시약 | Gibco | 15230-147 | |
| 셀 스트레이너 | 체 | BD 팔콘 | 352,340 | |
| T25 플라스크 | 문화 도자기 | Nalge Nunc 인터내셔널 | 136,196 | |
| T80 플라스크 | 문화 도자기 | Nalge Nunc 인터내셔널 | 178,905 | |
| 15 ML 튜브 | 문화 도자기 | BD 팔콘 | 352,096 | |
| 50 ML 튜브 | 문화 도자기 | BD 팔콘 | 352,070 | |
| EGF | 성장 인자 | R & D | 2028-EG | |
| B-FGF | 성장 인자 | R & D | 3139-FB | |
| 헤파린 | 성장 인자 | 시그마 | H4784 | PBS로 재구성 |
| 안티 - PSA-NCAM-PE | 항독소 | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE-복합 마우스 IgG1 | Isotype 제어 항체 | BD Pharminogen | 556,029 | |
| 헤파린 | 성장 인자 | 시그마 | H4784 | PBS로 재구성 |
| HrBMP-4 | 성장 인자 | R & D | 314-BP-010 | |
| 폴리-L-Ornithine | 시약 | 시그마 | P4957 | |
| 소태아 세럼 | 중간 보충 | Gibco | 10099-141 | |
| GFAP | 항독소 | DAKO | Z0334 | |
| B-III의 tubulin | 항독소 | Promega | G7121 |
* 앙, 믹스 1 X MEM 10 패 패킷 및 1M HEPES 160 ML을하고 증류수를 사용하여 8.75 L로 볼륨을 이끌 것이다. 7.4로 최종 PH를 설정 및 4 ° C.에 보관
참고문헌
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