Method Article

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

DOI:

10.3791/3736

⸱

July 8th, 2012

 ,  , 
1Institute for Research in Biomedicine, Bellinzona (Switzerland), 2Dipartimento di Biologia e Genetica per le Scienze Mediche, Universitá degli Studi di Milano

In This Article

Summary

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유동세포계측법의 골수 조혈 progenitors의 유통뿐만 아니라 효율적으로 분리 고도 정화 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 분석하는 방법을 설명합니다. 분리 절차는 본질적으로 세포 및 분자 연구를위한 HSCs를 정화 정렬 C-키트 + 세포와 세포의 자성 농축에 근거한다.

Abstract

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골수는 HSCs보다 성숙한 혈액 세포 가계 progenitors가 거주하고 성인 유기체에서 차별 교장 사이트입니다. HSCs는 삶의 시간을 1 모든 혈액 세포 lineages을 생성할 수있는 pluripotent 세포 분 세포 인구를 구성합니다. 골수에서 HSCs 항상성의 분자 해부는 조혈, 종양학 및 재생 의료에서​​ 중요한 의미를 가지고 있습니다. 우리는 형광 항체 및 개별 생쥐의 조혈 전구 하위 집합 및 HSCs 분포 (그림 1) 득점하기 유동세포계측법의 전자 게이팅 절차 라벨 프로토콜을 설명합니다. 또한 광범위하게 조혈 progenitors뿐 아니라 장기 (LT) 및 C-Kit를 표현하는 세포의 자성 농축하여 풀링된 골수 세포 현탁액에서 HSCs를 reconstituting 단기 (ST)를 풍부하게하는 방법을 설명합니다. 그 결과 세포 준비는 체외에 대해 선택한 하위 집합을 정렬하는 데 사용할 수 있습니다생체내 기능 연구에 대하여 (그림 2).

두 trabecular osteoblasts 2,3 및 sinusoidal 내피의 4 골수에서 HSCs을 지원하는 기능성 틈새를 구성합니다. N-cadherin + osteoblasts 3의 하위 집합과 그 리간드 angiopoietin-1 5 HSCs로 표현 수용체 티로신 키나제의 Tie2의 상호 작용을 포함 osteoblastic 틈새에서 몇몇 메커니즘은 HSCs의 정지를 결정하는데 동의합니다. 골수에서 "최대 절전 모드"는 과도한 사이클링 활동 6시 복제 및 최종 피로로부터 HSCs을 보호하기 위해 중요합니다. 이러한 수신자 같은 수용체 리간드 7, 인터페론-α 6 등 타고난 면역 계통의 세포에 따르고 외인성 자극에도 혈통이 커밋된 progenitors으로 확산 및 HSCs의 분화를 유도하실 수 있습니다. 최근 린 내에서 휴면 마우스 HSCs의 인구 - C-키트 + 무서-1 + CD150 + CD48 - CD34 - 인구가 8을 설명했습니다. 세포 정렬 여기에 설명된대로 조혈 progenitors 강화 세포 현탁액에서 CD34 표현에 따르면 허용 정지 자체 갱신 LT-HSCs과 ST-HSCs 9 모두의 고립. 혈통 긍정적인 세포의 고갈과 CD48와 Flk2 항체와 LT-HSC의 분류를 기반으로 유사한 절차는 이전에 10을 설명했습니다. 현재 보고서에서는 phenotypic 특성화 및 다른 생리 및 병리 학적 조건에서 조혈을 모니터하는 데 유용할 수 있습니다 조혈 progenitors의 전직의 생체내 세포주기 분석을 위해 프로토콜을 제공합니다. 더욱이, 우리는 요인 및 세포 생물학 및 신호 전달 장치 assays에서뿐만 아니라 이식에 대한 그들의 자기 갱신, 확장 및 분화를 조절 메커니즘을 정의하는 데 사용할 수 HSCs를위한 절차를 정렬 FACS에 대해 설명합니다.

Protocol

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1. 골수의 세포 현탁액의 준비

  1. 마우스를 안락사와 복부 뒤로 향해 스테인리스 냄비와 스프레이 70 % 에탄올에 동물을 배치하십시오. 대퇴골과 경골 뒷다리에서, 그리고 척추를 수집합니다.
  2. 정확하게 날카로운 팁 가위로와 거즈로 다리 뼈에서 척추에서 모든 연조직 잔류물을 제거합니다. 50 μm의 β-메르 캅 토 에탄올, 100 μm의 제품 MEM 비 필수 아미노산과 보충 10% 열 inactivated 태아 소 혈청 (FBS),, 1 밀리미터 MEM 나트륨 Pyruvate, 2를 포함하는 RPMI 매체 30 ML과 50 ML 팔콘 튜브의 상점 뼈 MM L-글루타민, 100 μg / ML의 스트렙토 마이신 및 100 U / ML 페니실린.
  3. 무균 필터와 이전에 소독을 절구의 바닥을 커버.
  4. 절구에 뼈를 전송 및 마찰 표면을 조립하기 위해 필터 계층으로 그들을 포괄합니다.
  5. 팔콘 필터와 함께 제공되는 50 ML 팔콘 튜브를 준비합니다.
  6. 뼈를 부술균일한 세포 현탁액을 얻기까지 유봉의 도움으로.
  7. 튜브로 정학을 전송합니다.
  8. 남아있는 세포를 씻고 기증 신선한 RPMI 전체 매체의 박격포 5 ML에 추가합니다.
  9. 균질 뼈를 확실히 나타날 때까지 마지막 두....

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Discussion

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여기서 설명한 방법은 개별 생쥐 (그림 1) 조혈의 신속하고 정확한 분석을 가능하게합니다. murine 염증의 모델, autoimmunity, 면역 결핍, 퇴행성 질환, 대사 질환 및 암 등 다양한 실험적 설정,이 분석은 조혈에 대한 병리 학적 조건의 영향을 해결하실 수 있습니다. 그림 3은 전자 문이 LKS의 세포 사이클링 활동의 분석을 보여줍니다 CD34 - KI-67 mab 및 DAPI로 더럽히는 것에 의해 건강한 마우스 및 염증성 장 질환 (IBD) 13과 생쥐의 세포. 후자는 세포주기의 S / G 2 / M 단계에서 세포의 상당한 증가를 표시합니다. 유동세포계측법에서 해당 분석 HSC 사이클링 활동 12 T 세포 매개 염증의 영향을 보여줍니다.
세포와 C-Kit를 표현 자성 라벨링 및 골수 세포의 농축의 조합은 흐름 cytometr으로 정렬y는 .......

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Disclosures

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

Acknowledgements

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우리는 귀중한 조언을 Nobuyuki Onai, 히토시 타키자와 마르쿠스 Manz 감사드립니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단, 스위스 암 리그와 Fondazione Ticinese마다 라 RIcerca ㅡ Cancro에 의해 재정 지원되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
시약의 이름 회사 카탈로그 번호
RPMI 1640 Gibco 42,401
MEM NEAA 100X Gibco 11,140
나트륨 Pyruvate Gibco 11,360
PenStrep Gibco 15,070
PBS Gibco 20,012
FBS Gibco 16,000
셀 스트레이너 40 μm의 BD 팔콘 352,340
7-AAD의 염색법 솔루션 BD Pharmingen 559,925
버퍼를 Lyse / 수정 BD Pharmingen 558,049
버퍼 III를 파마 BD Pharmingen 558,050
KI-67 BD Pharmingen 556,026
DAPI Invitrogen D21490
CD4 (GK1.5) eBioscience 150,041
CD8 (53-6.7) eBioscience 150,081
인 경우에는 3 번 CD (145-2C11) eBioscience 150,031
CD45R (RA3-6B2) eBioscience 150,452
CD19 (6D5) eBioscience 150,193
Gr1 (RB6-8C5) eBioscience 155,931
Tre119 (TER-119) eBioscience 155,921
NK-1.1 (PK136) eBioscience 455,941
C-키트 (2B8) eBioscience 171,171
SCA-1 (D7) eBiosci줬어 135,981
CD34 (RAM34) eBioscience 110,341
FcγR (2.4G2) eBioscience 553,145
안티 APC의 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-855
LS 열 Miltenyi Biotec 130-042-401

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
  2. Calvi, L. M. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425, 841-846 (2003).
  3. Zhang, J.

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Hematopoietic Stem CellsFlow CytometryMagnetic EnrichmentBone Marrow Isolationc Kit Positive CellsPhenotypic AnalysisCell SortingLineage committed ProgenitorsHSC QuiescenceEx Vivo Analysis

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