Monocytes과 인간 혈액의 작은 샘플에서 돌기 세포의 리니지 특정 수신자 같은 수용체 - 매개 시그널링의 정량 이미징

Summary

우리는 (ImageStream 기술의 사용을 설명 www.amnis.com), 당신이 잘 정의된 환자의 동료에서 일차 면역 세포의 세포 메커니즘을 계량하기 위해, 동시 고해상도 디지털 영상과 함께 양적 유동세포계측법을 자랑합니다. 우리의 연구 주제 무리에서 소형 시료의 혈통 특정 세포 반응을 계량하기위한 translational 수사 청사진을 제공합니다.

Abstract

면역 상태에서 개별 유사 감염에 반응을 파악하고 질병의 심각도 및 결과에 기여. 고령화는 바이러스성 및 세균성 감염으로 증가 자화율와 연관된와 체액에 잘 문서화된 감소뿐만 아니라 세포 매개 면역 반응의 ^1,2와 백신에 반응을 감소합니다. 우리는 최근에 수신자와 같은 수용체 (TLRs), 미생물 감염 및 트리거 항균 호스트 방어 반응 ³ 감지 타고난 면역 시스템의 주요 구성 요소에 노화의 영향을 평가했습니다. 건강한 인간 기증자의 큰 일대에서, 우리는 노인에서 해당 말초 혈액 monocytes 표현 및 특정 TLRs ^4와 돌기 세포에서 유사한 감소 TLR 수준 및 신호 응답 (DC가)의 기능을 감소 보여줬에 필수적입니다 세포를 항원 제시 타고난 및 적응 면역 ⁵ 사이의 결합. 우리는 macrophages에 TLR3의 dysregulation을 보였습니다웨스트 나일 바이러스 ^6,7와 감염에 대한 반응으로 노인 기증자로부터 DC가에 의한 IFN의 D 낮은 생산.

immunosenescence 우리의 이해와 치료 개입 파라마운트 응답 특정 세포 유형에 대한 자세한 이해와 신호 전달의 메커니즘 (들)입니다. FACS 또는 immunoblot에 의해 일차 전지 및 측량 세포 마커 영상을 통해 면역 반응의 전통적인 연구 결과 그러나 이러한 연구는 일반적으로 환자에서 제공하는 작은 샘플 볼륨과 여러에 복잡한 실험실 기술을 수행하는 무능력에 의해 기술적으로 제한되며, 크게 우리의 이해를 전진했습니다 인간의 샘플. ImageStream 동시 고해상도 디지털 영상과 양적 유동세포계측법을 결합하기 때문에 환자 자화율의 효율적인 캡처를위한 contemporaneously 여러 세포 인구의 조사를 용이하게합니다. 여기에서 DC가 ImageStream의 사용을 평가하기 위해 입증 TLR7 / 8인산화 및 면역 반응 ^8에 대한 중요한 여러 유전자의 전사를 시작하는 주요 전사 인자, NF-κB의 핵 translocation의 활성화 - 중재 증가합니다. 우리는 또한 최근 TLR5 신호와 ⁹ 노화에 변경된 면역 반응에 기여할 수 오래된 기증자로부터 monocytes에서 NF-κB 경로의 이전에 인식되지 않는 변경을 보여,이 기술을 사용했습니다.

Protocol

1. 면역 세포의 분리 및 자극

1. 지역 기관 검토위원회의 지침하에 작성된 정보에 동의 후 건강한 자원자에서 10-50 ML heparinized 혈액을 구합니다. 노화 또는 질병의 연구를 위해 각 자원이나 환자에 대한 pathogenesis, 배제와 포함 조건은 명시적으로 결정되어야합니다.
2. CPT 튜브 또는 Ficoll-Paque을 사용하는 플러스 격리 ⁷ (시약, 표 1) 당일 제조 업체의 지침 (GE 헬스케어, 뉴저지)과 행동 실험에 의하면 인간의 말초 혈액 mononuclear 세포 (PBMCs) 분리.
3. 품어 PBMCs (3 × 10 ⁶ / 튜브) 혼자서 0.6 ML 매체에서 1.5 ML 튜브 또는 TLR의 리간드 또는 다른 활성 요원 예로 자극 TLR7 / 8 리간드 R848 (0.6 ML 매체 추가로 10 MM TLR7 / 8 리간드의 0.6 μl 10-60 분 (InvivoGen, CA) ⁹ 37 ° C에서 R848, 최종 농도 10 μm의)가.

2. 연구소세포 eling

1. 라벨 세포 혈통과 fluorescently - 복합 항체를 사용하여 라이브 세포 현탁액....

Discussion

translational 연구를위한 ImageStream의 사용에서 중요한 단계는 관련 비교 그룹 및 최적화 및 항체 특이성의 검증의 선택입니다. 분류 대상에서 대상 그룹 간의 차이점 histograms 및 세포 영상을 통해 예가 될 것입니다. 관련 수용체 및 신호 전달 경로의 변화에​​ 대한 철저한 분석과 결합된 이러한 데이터는 전문적인 동료에 면역 dysregulation을 기초 메커니즘에 귀중한 통찰력을 제공할 것입니다. 기술은 관련 대상에 대한 충분한 친화력의 특정 항체의 유무에 의해 제한됩니다. 또한, 악기는 다중 사용자 시설에 가장 적합하며 분석 소프트웨어는 어떤 치료가 습득해야합니다.

이 기술은 인간의 질병 translational 수사 강력한 기술입니다. 게놈 시퀀싱 및 배열 기술의 발전은 허용할 m에 연루 변종을 식별어떤 질병이지만 드물게 지명 유전자의 행동의 메커니즘을 파악 없습니다. 우리의 연구는 자극 후 NF-κB의 세포질 비율 핵 개별 과목 transl.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
Ficoll-Paque 플러스	GE 헬스케어	17-1440-03
R848	Invivogen	tlrl-r848
Paraformaldehyde (16 %)	전자 현미경 과학	15,710
BD는 파마 / 쉐이브	BD Biosciences	554,723
CD14-PE	eBioscience	12-0149-41
CD4-PacBlue	BD Pharmingen	68,436
리니지 칵테일 1 (린 1)-FITC	BD Biosciences	340,546
CD11c-PE	BD Biosciences	347,637
CD123-PE	BD Biosciences	340,545
토끼 반 NF-κB (p65)	SantaCruz	SC-372
Alexa647 F (AB ') 2 염소 항 토끼 IgG	Invitrogen	A21246
DAPI	Invitrogen	D21490
ImageStream X	Amnis

셀 유형	FITC	PE	알렉사 647	PacBlue
단핵구		CD14	NF-κB (p65)
MDC	Lin1	CD11c	NF-κB (p65)	CD4
PDC	Lin1	CD123	NF-κB (p65)	CD4