방법 논문

TransFLP - 유 전적으로 수정하는 방법 장염 cholerae 자연 변화와 FLP-재조합에 근거

DOI:

10.3791/3761

⸱

2012년 10월 8일

1Global Health Institute, School of Life Sciences, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

이 논문에서

요약

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의 게놈을 수정하는 빠른 방법 V. cholerae이 설명되어 있습니다. 이 수정 한 유전자, 유전자 클러스터와 게놈 섬뿐만 아니라 짧은 시퀀스 (예 : 프로모터 요소 또는 선호도 태그 시퀀스)의 통합의 삭제가 포함되어 있습니다. 방법은 자연의 변화와 FLP-재조합에 기반을두고 있습니다.

초록

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몇 가지 방법이 박테리아 염색체 1-3 조작 할 수 있습니다. 이러한 프로토콜의 대부분은 (예 : PIR에 따라 달라 나 온도에 민감한 replicons에게 1,2을 품고) 조건 replicative의 plasmids의 삽입에 의존하고 있습니다. 이러한 plasmids은 호몰 로지로 인한 재조합에 따라 세균​​ 염색체에 통합되어 있습니다. 이러한 insertional 돌연변이는 종종 직접 실험 설정에 사용됩니다. 또는 손실에 이어 플라스미드 절단에 대한 선택은 종종 sacB 유전자 넷으로 인코딩 된 카운터 선택 레반의 sucrase 효소에 의존 그람 음성 박테리아있는 수행 할 수 있습니다. 절단 중 하나 미리 삽입 유전자형 또는 염색체와 수정 된 유전자의 플라스미드 인코딩 복사본 사이의 교류의 결과를 복원 할 수 있습니다. 이 기법의 단점은 시간이 많이 걸리는 점입니다. 플라스미드는 먼저 복제 할 수 있습니다, 그것은 V.으로 수평 이동이 필요합니다 cholerae (대부분 N otably E.와 결합하여 대장균의 기증 부담) 또는 후자의 인공 변환 및 플라스미드의 절단은 임의입니다하거나 초기 유전자형을 복원하거나 더 긍정적 인 선택이 가해되지 않을 경우 원하는 수정을 만들 수 있습니다. 여기, 우리는 V.의 빠른 조작하기위한 방법을 제시 cholerae의 염색체 (들) 5 (그림 1). 이 TransFLP 방법은 같은 V.으로 속 장염의 유기체 6 다른 대표의 자연 능력의 최근에 발견 된 키틴로 인한 유도를 기반으로 fischeri 7. 자연 능력은 PCR 생성 된 DNA 조각을 포함한 무료 DNA의 이해 할 수 있습니다. 일단 차지하고, DNA가 일치하는 지역 8 측면을 노릴의 250-500 BP의 최소의 존재 주어진 염색체와 recombines. 이러한 측면을 노릴 지역에서 중간 선택 마커를 포함하면 자주 발생 transformants을 쉽게 감지 할 수 있습니다. t는 ">이 방법은 V. cholerae의 다른 유전자 조작에 사용되며 잠재적으로 다른 자연적 능력이 박테리아 할 수 있습니다. 우리는 이전에 다음 ID로 출판 단일 유전자 삭제에 대한 연구와에 추가이 방법에 의해 수행 될 수있는 세 개 소설 예제를 제공합니다 연관성 태그 시퀀스 5 추가가. 키틴 유발 자연 변화 6의 초기 프로토콜에 관한 몇 가지 최적화 단계는이 TransFLP 프로토콜에 통합되어 있습니다.이 다른 사람들 사이에 상업적으로 이용 가능한 키틴 조각 8, PCR의 기부에 의한 게 껍질 조각의 교체를 포함 자료 9, FLP - 재결합 대상 사이트 (FRT) 5의 추가를 변형 등의 파생 DNA. FRT 사이트는 Flp recombinase (10)에 의해 중재 선택 마커의 사이트 감독 절단 할 수 있습니다.

프로토콜

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TransFLP 방법 (그림 1)은 세 가지 다른 방법으로 예시되어 있습니다 : I) V.의 독성의 determinants를 인코딩 두 개의 인접한 유전자의 삭제 cholerae (예를 들어, ΔctxAB), II) pathogenicity 섬 (예 : ΔVPI-1)의 제거 및 III) T7 RNA의 효소에 의존 발기인 시퀀스의 통합은 업스트림 유전자 수준의 관심, 이후 수의 각각의 변형을 배경으로 인공 표현 (예를 들어, T7-tfoX) (그림 2).

1. 키틴 플레이크의 작성

  1. 표준 1.5 ML 플라스틱 관 키틴 조각의 무게 50-80 밀리그램. 이것은 대량으로 준비 할 수 있습니다. 키틴 조각은 시그마 (cat. 번호 C9213)에서 상업적으로 이용할 수 있습니다.
  2. 관의 뚜껑이 열려 유지 그 조각을 압력솥.
  3. 압력솥이 냉각 된 후 즉시 뚜껑을 닫습니다.
  4. 스토어 autoclaved 키틴 조각상온에서.

2. 선택 사항 : V.의 인공 변환 Flp Recombinase 인코....

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결과

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세 가지 예 대표 결과는 6도 4에 표시됩니다. 첫 번째 접근 방식은 이웃 한 유전자에게 ctxA과 ctxB을 삭제하기위한. 이들은 V.의 주요 독성 계수를 인코딩 cholerae, 콜레라 독소. 위에서 설명한 3 그림에 따라 우리는 TransFLP 방법에 대한 oligonucleotides를 설계했습니다. 부모의 변형은 ctxAB의 원래 DNA의 궤적과 ctxAB에 대한 삭제 저항 카세트의 해제 최종 변형에서 FRT-둘러싸인 항생제 저항 카세트를 숨겨 중간 변종은 (그림 4)의 유전자형을 위해 테스트되었습니다. 선택의 방법은 전체 셀 PCR했다. 우리는 만 염색체 DNA에 변화 PCR 조각 (그림 3)에 단련하지 않는 프리 머를 사용했습니다. 이 우리가 염색체의 상동 지역 (F와 함께 PCR 조각.......

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토론

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TransFLP 방법은 5 광범위하게 저희 연구실에서 사용 된 이상, 다른 곳에서 설명했다. 가능한 아르 유전자 조작의 종류는 다른 이들과 같습니다 : 하나의 유전자 및 유전자 클러스터의 삭제, 게놈 섬의 삭제 (예 : VPI-1) 관심 유전자 (예를 들어, 발기인 시퀀스)의 상류 시퀀스의 삽입과 삽입을 특정 유전자 (예를 들어, 인코딩 연관성 태그)의 끝 부분에 시퀀스.

TransFLP에 대한 수입 전제 조건은 각각의 V.입니다 cholerae 변형은 자연스럽게 transformable 있습니다. 이 기능은 특히 콜레라 환자에서 파생 분리에, 때로는 그렇지 않습니다. 이러한 긴장은 자주 정족수 감지, HapR 17의 주요 레귤레이터를 인코딩 유전자 내에서 정족수 감지 회로 예에서 변이되어 있습니다. hapR의 복사본을 다시 제공하는 것은 e.......

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공개 사항

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

감사의 글

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나는 기술 지원을 위해 올가 드 수자 실바을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (SNSF) 부여 31003A_127029에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트
키틴 조각 시그마 C9213 필요 Autoclaving
선택 사항 : Micropulser (경우에 항생제 카세트는 PBR-flp에 인코딩 Flp의 recombinase에 의해 excised 수 있습니다) Biorad 165-2100 또는 비교 electroporators

참고문헌

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  1. Miller, V. L., Mekalanos, J. J. A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988).
  2. Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R.

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재인쇄 및 허가

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태그

Natural TransformationFLP RecombinationVibrio choleraeChitin InductionPCR FragmentsFRT SitesAntibiotic ResistanceGenetic ManipulationSite Directed ExcisionPlasmid Curing

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