우리는 글루코사민과 흙에서 추출한 muramic 산성의 aldonitrile 아세트산 유도체의 GC-기반의 분석을위한 메소드 프로토콜을 설명합니다. 화학적 메커니즘의 해설 들어, 우리는 또한 유도체와 전자 이온화 따라 형성된 이온 조각의 구조를 확인하기위한 전략을 제시한다.
방법 논문
우리는 글루코사민과 흙에서 추출한 muramic 산성의 aldonitrile 아세트산 유도체의 GC-기반의 분석을위한 메소드 프로토콜을 설명합니다. 화학적 메커니즘의 해설 들어, 우리는 또한 유도체와 전자 이온화 따라 형성된 이온 조각의 구조를 확인하기위한 전략을 제시한다.
특성화 미생물에 대한 양적 접근 방식은 생태계 내에서 미생물의 상태와 기능의 폭넓은 이해를위한 열쇠입니다. 미생물 분석을 위해 현재의 전략은 전통적인 실험실 문화에 종속적인 기술과 직접 추출 및 특정 생체 1, 2의 결정을 바탕으로 이들을 모두 포함합니다. 흙을 거주 미생물 종의 다양성 가운데 몇몇은 배양해 때문에 문화 종속적인 방법은 상당한 편견, biomarker 분석의 부재 제한을 소개합니다.
글루코사민, mannosamine, galactosamine 및 muramic 산성이 잘 토양 시스템 3의 가장 중요한 성분은 이러한 글루코사민 (가장 풍부)와 muramic 산성 (고유 세균 세포에서)으로 인해 생활과 죽은 미생물의 질량 모두 대책을 역임했습니다 4. 그러나 분석에 대한 지식의 부족은 과학적인 또래 간의 폭넓은 보급을 제한합니다. 모든 exi 중에서aldononitrile로 derivatization를 분석 방법을 아프게하는 것은 GC 기반의 분석을 다음 acetates 최적의 정밀도를 균형에 관하여 좋은 옵션으로 떠오르고, 감도, 단순, 샘플 보관 5시 좋은 색층 분리, 안정성.
여기서는 aldononitrile의 acetates에 대한 그들의 변환 후 토양에서 글루코사민과 muramic 산성의 안정적이고 비교적 간단한 분석을 위해 상세한 프로토콜을 소개합니다. 프로토콜은 주로 4 단계를 구성되어 산성 소화, 샘플 정제, derivatization 및 GC 결정합니다. 단계별 절차는 옛 간행물 6, 7에 따라 수정됩니다. 또한 구조적으로 전자 이온화에 따라 형성 유도체와 그 이온 조각의 분자 이온의 유효성을 검사하기위한 전략을 제시한다. 우리는 aldononitrile 아세테이트 derivatized 글루코사민과 mur의 분자량을 결정하기 위해 GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS 및 isotopically 분류된 시약을 적용amic 산은, 우리는 각 파생 상품 8 이온 조각을 조사하기 위해 이온 스펙트럼에서 동위 원소 라벨이 표시된 파생 상품의 대량 교대를 사용했습니다. 이론적 해설과 더불어, 파생 및 이온 조각의 분자 이온의 유효성 검사 δ 13 C 또는 biogeochemical 연구 9, 10에서 이러한 생체 이온 조각을 사용하여 연구자에게 도움이 될 것입니다.
1. 샘플 준비 및 산성 추출
2. 샘플 정제
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aldononitrile 아세트산 derivatized 글루코사민과 muramic 산성의 분석을 위해 제시 GC 기반 방식은 토양에서 추출한 이러한 아미노산 설탕을 계량하기 위해 비교적 빠른 방법을 제공합니다. 파생 상품은 화학적으로 안정, 한 분석에서 확인할 수 있습니다. 방법은 토양 샘플에 국한되지 않고, 비 토양 매트릭스에서 샘플에 대해 간단하게 할 수 있습니다.
이 방법에 사용되는 진공 펌프는 산성에 강한 것으로 만들어졌습니다. 우리는 더 6M HCL 솔루션을 증발 때 펌프를 보호하는 기본 트랩을 설정하는 것이 좋습니다. 케어는 시약과 유리 모두를 위해 엄격하게 무수 조건을 유지하기 위해 derivatization 단계 동안 촬영해야합니다. 작품은 지체없이 실시하여야한다. 유리도 550 ° C에서 muffling 또는 용매와 rinsing하여, 가끔 표시되는데, 깨끗한 있어야합니다. 안전 조치는 산, 그리고 증발하는 동안 강한 산성 증기의 취급을 위해 촬영해야합.......
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우리는 공개 할게 없다.
이 작품은 검사서 오대호 Bioenergy 연구 센터 (DE-FC02-07ER64494 과학 검사서 BER 사무실)에서 교부금에 의해 지원되었다. 우리는 박사 Xudong 장 및 프로토콜을 마무리 유용한 기술적인 토론과 소중한 의견에 대한 자신의 그룹 회원들에게 감사를드립니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| Muramic 산 | 시그마 - 올드 리치 | M2503-25MG | |
| D-(+)-글루코사민 염산염 | 시그마 - 올드 리치 | G1514-100G | |
| N-메틸-D-glucamine | 시그마 - 올드 리치 | M2004-500G | |
| Myo - 이노시톨 | 피셔 과학 | A307003G025 | |
| 메탄올 (건조) | Acros의 유기물 | AC326950010 | |
| 4 - 디메틸 아미노 - 피리딘 | Acros의 유기물 | AC148270050 | |
| 에틸 아세테이트 | VWR 인터내셔널 | BJGC100-4 | |
| Hydroxlamine 하이드로 클로라이드 | 피셔 과학 | H330-100 | |
| 피리딘 | 피셔 과학 | P368-500 | |
| 아세트산 무수물 | 피셔 과학 | A10-100 | |
| Dichloromethane (메틸렌 클로라이드) | 피셔 과학 | D37-500 | |
| 헥산 | 피셔 과학 | H303-4 | |
| 염산의 산성 (6M) | 피셔 과학 | S456-4 | |
| 히드록 실 아민 하이드로 클로라이드 -15 N | 아이콘 서비스 | IN5280 | |
| 아세트산 무수물 -2 H (D 6 C 4 O 3) | Acros의 유기물 | AC174670050 | |
| D-글루코오스-U -13 C | 캠브리지 동위 원소 연구실 | CLM-1396-1 | |
| 암모늄 sufate -15 N | 캠브리지 동위 원소 연구실 | NLM-713-1 | |
| 장비의 명칭 | 회사 | 유형 | |
| 급속 Vap | LabConco | 790,002 | |
| Vacum 펌프 | KNF Neuberger | D-79112 | |
| 가수 분해 플라스크 | 피셔 과학 | 06 423A | |
| Derivatization의 microvial | 피셔 과학 | 06-100E | |
| GC | 휴렛 팩커드 | 6890 | |
| MS | 휴렛 팩커드 | 5972 | |
| LC-ESI-TOF-MS | 애질런트 | 애질런트 1200 시리즈 HPLC 시스템은 애질런트 LC / MSD-TOF로 결합 |
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