세포 생물학의 기본적인 탐구는 진핵 세포를 만드는 organelles의 신원을 기초 메커니즘을 정의하는 것입니다. 여기 형광 현미경과 차세대 시퀀싱 도구를 사용하여 식물 organelles의 형태학의 기능적인 무결성에 대한 책임 유전자를 식별하는 방법을 제안합니다.
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방법 논문
형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구
이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 Arabidopsis 모종의 형광 현미경 기반 검사를 설명하고 분비 경로에서 특정 태그를 형광 마커의 subcellular 분포를 변경 열성 돌연변를 매핑하는 방법에 대해 설명합니다. Arabidopsis 때문에 자사의 게놈 크기의 유전자 연구를위한 강력한 생물 학적 모델이며, 생성 시간, 그리고 왕국 간의 분자 메커니즘의 보존. 분자 마커를 기반으로 전통적인 방법과 대안에 변이를 매핑하는 방식으로 genotyping 배열은 비교적 빠른 있기 때문에 유리하고 아주 짧은 기간에 여러 돌연변이의 매핑을 허용할 수 있습니다. 이 방법은 식물의 어떤 organelle의 무결성에 영향을 미칠 수있는 단백질의 식별이 가능합니다. 여기 예로, 우리는 endoplasmic reticulum (ER)의 무결성을위한 중요한지도 유전자에 대한 화면을 제안합니다. 우리의 접근법은 그러나, 쉽게 다른 식물 세포 organelles로 연장하실 수 있습니다(예를 들어 1,2 참조), 따라서 다른 subcellular 구조를 지배하는 분자 기초를 이해 향한 중요한 단계를 나타냅니다.
프로토콜
1. EMS 치료
Arabidopsis thaliana의 씨앗은 T / 돌연변이 5-7로 C / G 그 결과 게놈 C - 투 - T 변화로 유도 mutagen 에이전트 에틸 메탄 산염 (EMS) 3,4로 사용 mutagenized됩니다.
- organelle 형광 마커를 (특히, 본 연구에서는 ssGFPHDEL는 (신호 시퀀스-GFP-HDEL tetrapeptide) ER 마커로 사용되었습니다) 운반 0.8 g Arabidopsis 종자를 (~ 40,000 씨앗) 무게.
- 50 ML 팔콘 튜브의 씨앗을 전송 후 25 ML 증류수를 추가합니다.
- 0.2 % (V / V) 에틸 메탄 산염을 추가합니다.
- 낮은 속도로 믹서를 nutating 16 번 시간 동안 알을 품다.
- 액체를 대기음 및 1.0 M NaOH는 EMS를 inactivate이 포함된 플라스크에 그 파일을 삭제.
- 가까이, 씨앗을 포함 팔콘 튜브 25 ML 물을 추가하고 5 번 반전을 씨앗을 씻어, 모든 씨앗이 정착 때까지 기다려 다음, 1.0 M 나에 물을 대기음 및 폐기 플라스크, 오하이오.
- 최대 ....
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토론
여기 endomembrane의 돌연변이의 식별을 위해 공촛점 현미경 기반 검사를 설명했다. 이 접근법은 쉽게 특정 형광 단백질 마커를 사용할 수있는 세포의 다른 organelles로 연장하실 수 있습니다. 화면이 대상 organelle이나 마커를 포함해야하지 않는 organelles로 중 형광 마커의 탈선 분포를 보여 돌연변이의 신분에 따라 달라집니다. 각각 이러한 돌연변 마커를 subcompartimentalize하기 organelle의 능력 중 하나가 손상되는 인구 않거나 제대로 organelles 중에서 마커를 이동시키다 수없는 돌연변이를 나타냅니다. 심사 기간 동안 우리는 어떤 뮤턴트 이르면 칠일 발아 후 빠르면 개발 단계 표현형을 보여주 것으로 파악되지만, 다른 단지 개발 이후 단계에 표현형을 보여주었다. 이것은 변이된 개발 종속적인 표현을 포함한 여러 가지 이유로 연결할 수 있지만allele (들),이 식물은 잠재적으로 흥미있는 돌연변이 삭제되지 않도록 보장하기 위해 (적어도 7~14일) 다른 성장 단계에서 검토되어.......
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공개 사항
우리는 공개 할게 없다.
감사의 글
우리는 화학 과학, Geosciences 및 Biosciences 부문, 기초 에너지 과학, 과학의 사무실, 에너지의 미국과 (보너스 번호 DE-FG02-91ER20021) 및 국립 과학 재단 (MCB 0,948,584) (FB)의 사무실에 의해 지원을 인정합니다. 우리는 원고를 편집 미스 카렌 버드에 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| Ethylmethane의 산염 | 시그마 | M0880 | |
| NaOH | JT 베이커 | 3722-05 | |
| Murashige skoog 기초 매체 w gamborg 비타민 | 피토 technolog laboratorie | M404 | |
| Phytagel | 시그마 | P8169-1kg | |
| RNeasy 미니 키트 | Qiagen | 74,104 | |
| 마스터 순수 식물 잎의 DNA 정제 키트 | Epicentre | MPP92100 | |
| Bioprime의 DNA 라벨링 시스템 | Invitrogen | 18094-011 | |
| 알콜 200 증명 | Decan 실험실 INC. | 2716 | |
| NaOAc | JT 베이커 | ||
| 유전자 칩 Arabidopsis의 ATH1게놈 배열 | Affymetrix | 900,385 | |
| 팔콘 튜브 50 ML | 코닝 | 430,290 | |
| Eppendorf 튜브 1.5 ML | |||
| 90mm 필터 종이 | 워트 먼지 | 1,001,090 | |
| 분석 잔액 | Mettler 톨레도 AB54-S | NA | |
| Nutating (웨이브) 흔드는 | Heidolph polymax 1040 | NA | |
| 원심 분리기 | Eppendorf 5417-R | NA |
참고문헌
- Marti, L. A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway. The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).
- Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F.
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재인쇄 및 허가
